催產(chǎn)素受體基因多態(tài)性與分娩方式關(guān)系的初步研究

呂青青，張洪影，孫麗芳，丁楠，徐宇菲，鄂文

人類分娩啟動(dòng)和開始的生理機(jī)制目前仍不明確，現(xiàn)在認(rèn)為分娩是多因素作用、多種途徑調(diào)節(jié)和多個(gè)階段變化的過程，在臨床常使用催產(chǎn)素作為啟動(dòng)和促進(jìn)產(chǎn)程進(jìn)展的藥物，但催產(chǎn)素的具體作用機(jī)制仍有待研究。催產(chǎn)素水平升高或子宮肌層催產(chǎn)素受體數(shù)量增加是人類分娩發(fā)動(dòng)的主要因素。有研究發(fā)現(xiàn)，催產(chǎn)素受體基因影響第一產(chǎn)程時(shí)間，催產(chǎn)素受體基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs53576為GG表型的孕婦進(jìn)入活躍期較晚，總產(chǎn)程較長(zhǎng)[1]。本研究比較催產(chǎn)素受體基因在陰道分娩及剖宮產(chǎn)孕婦中分布差異及其在分娩過程中的作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年9月—2017年1月于北京積水潭醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的妊娠足月計(jì)劃陰道分娩單胎妊娠婦女150例為研究對(duì)象，年齡(29.38±2.67)歲，身高(162.56±4.37)cm，BMI(21.78±3.01) kg/m2，分娩孕周37+2～41+5周。入院當(dāng)天采集產(chǎn)婦的年齡、身高、孕次，核對(duì)妊娠周數(shù)，分娩當(dāng)天的體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，分娩當(dāng)天記錄產(chǎn)程進(jìn)展：宮口開大、胎心變化及胎頭下降情況及最終的分娩結(jié)局。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦及家屬均知情同意并簽署協(xié)議書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：初產(chǎn)婦、自然受孕，入院評(píng)估預(yù)計(jì)胎兒體質(zhì)量≤4 000 g，并計(jì)劃陰道分娩的孕婦；以剖宮產(chǎn)分娩的孕婦選取因“產(chǎn)程停滯”在第一產(chǎn)程中行剖宮產(chǎn)分娩者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并妊娠高血壓疾病、多胎妊娠及異常胎位的孕婦；而剖宮產(chǎn)孕婦，除外因孕婦意愿、胎兒因素、宮內(nèi)感染等行剖宮產(chǎn)分娩孕婦。

1.3 產(chǎn)程中催產(chǎn)素使用情況 觀察并記錄每例孕婦產(chǎn)程進(jìn)展，若宮縮不規(guī)律，可使用催產(chǎn)素促進(jìn)產(chǎn)程進(jìn)展。參照2014年我國(guó)妊娠晚期引產(chǎn)指南[2]中的催產(chǎn)素使用規(guī)范，起始催產(chǎn)素應(yīng)從小劑量循序增量，起始劑量為2.5 U 溶于乳酸鈉林格注射液500 ml中(0.5%濃度) 靜脈滴注，每分鐘8滴開始，根據(jù)宮縮、胎心情況調(diào)整滴速，一般每隔20 min調(diào)整1次。應(yīng)用等差法，即從每分鐘8滴調(diào)整至16滴，再增至24滴；也可從每分鐘8滴開始，每次增加4滴，根據(jù)宮縮情況調(diào)整滴速，直到出現(xiàn)有效宮縮則維持現(xiàn)有滴速及濃度。統(tǒng)計(jì)在產(chǎn)程中使用催產(chǎn)素的個(gè)體。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 催產(chǎn)素受體基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs53576位點(diǎn)等位基因“A”或“G”檢測(cè)：產(chǎn)婦入院后取靜脈血2 ml，于采集后8 h內(nèi)冷鏈運(yùn)送，無菌條件下2～8℃保存2 d，經(jīng)血液基因組DNA提取后-20℃以下保存。DNA提取：試劑盒購于北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司，在1.5 ml離心管中加入10 μl蛋白酶K和EDTA抗凝全血100 μl并混勻，離心10 s，加入緩沖液B 200 μl顛倒混勻，56℃放置10min，期間顛倒混勻2～3次，加入無水乙醇200 μl顛倒混勻，并加入吸附柱離心30 s，棄除廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入緩沖液C 500 μl，離心30 s倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入漂洗液W 2 700 μl，離心30 s倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，向吸附柱中加入漂洗液W 2 500 μl，離心30 s倒掉廢液，將吸附柱放回收集管，然后離心2 min，將吸附柱置于一個(gè)新的1.5 ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，向吸附膜中間部位懸空滴加洗脫緩沖液TE 100 μl，室溫放置2～5 min，離心2 min，收集管中即為基因組DNA。PCR擴(kuò)增：使用由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系自主設(shè)計(jì)探針和引物，熒光PCR儀擴(kuò)增。使用單鏈多態(tài)性分析儀(杭州柏恒科技有限公司，型號(hào) GT6022)，通過Taq-man熒光PCR檢測(cè)待檢樣品候檢位點(diǎn)的基因型，不同基因型顯示結(jié)果各異：AA型顯示結(jié)果為FAM標(biāo)記探針擴(kuò)增；AG型和GG型結(jié)果為FAM標(biāo)記探針和VIC標(biāo)記探針同時(shí)擴(kuò)增，或者VIC標(biāo)記探針擴(kuò)增。根據(jù)催產(chǎn)素受體基因分型進(jìn)行分組：由于rs53576表型分布不均，結(jié)合已有的實(shí)驗(yàn)，本研究分為“A”(即AA型)表型組和“G”(即AG/GG)表型組。

1.4.2 產(chǎn)程進(jìn)展及分娩結(jié)局：對(duì)同一時(shí)間段入院孕產(chǎn)婦常規(guī)進(jìn)行產(chǎn)科入院評(píng)估，評(píng)估一般生命體征，宮頸成熟度、胎兒情況，產(chǎn)程處理按照《婦產(chǎn)科學(xué)(第9版)》[3]產(chǎn)程處理原則，產(chǎn)程中由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的助產(chǎn)人員評(píng)估宮頸口擴(kuò)張及胎頭下降程度，并繪制產(chǎn)程圖，產(chǎn)程中持續(xù)使用胎心監(jiān)護(hù)，剖宮產(chǎn)的指征按照《婦產(chǎn)科學(xué)(第9版)》原則，并記錄分娩方式。

1.4.3 新生兒出生體質(zhì)量： 新生兒分娩后測(cè)量出生體質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 分娩及催產(chǎn)素應(yīng)用情況 150例產(chǎn)婦中順利陰道分娩133例(88.7%)，行剖宮產(chǎn)分娩17例(11.3%)，手術(shù)指征分別為產(chǎn)程進(jìn)展停滯或引產(chǎn)。150例產(chǎn)婦產(chǎn)程中使用催產(chǎn)素(原因分別為宮縮乏力、產(chǎn)程停滯)42例(28.0%)，其中12例(28.6%)以剖宮產(chǎn)為分娩結(jié)局；未使用催產(chǎn)素108例(72.0%)，其中5例(4.7%)以剖宮產(chǎn)為分娩結(jié)局，兩者剖宮產(chǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.250，P=0.000)。

2.2 催產(chǎn)素受體基因(rs53576)表達(dá)情況 150例產(chǎn)婦中OXTR rs53576位點(diǎn)為AA型80例(53.3%)，GG型8例(5.4%)，AG型62例(41.3%)。陰道分娩產(chǎn)婦OXTR rs53576為AA型純合子多于GG/AG型，剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦以GG/AG型為主，2組基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.408，P=0.036)，見表1。

表1 不同分娩方式催產(chǎn)素受體基因rs53576位點(diǎn)表型比較 [例(%)]

2.3 催產(chǎn)素使用情況與基因型比較 比較產(chǎn)程中使用催產(chǎn)素和未使用催產(chǎn)素的產(chǎn)婦OXTR的SNP，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陰道分娩133例產(chǎn)婦，產(chǎn)程中使用催產(chǎn)素和未使用催產(chǎn)素的OXTR基因rs53576表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 催產(chǎn)素不同使用情況催產(chǎn)素受體基因rs53576位點(diǎn)基因型比較 [例(%)]

2.4 新生兒體質(zhì)量比較 “G”表型(GG/AG)的新生兒出生體質(zhì)量為(3 432.86±387.76)g，“AA”表型的為(3 410.63±344.92)g，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.706，P=0.402)。剖宮產(chǎn)分娩的新生兒體質(zhì)量為(3 435.29±435.81)g，陰道分娩為(3 419.17±356.21)g，兩者比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.247，P=0.620)。

2.5 催產(chǎn)素受體基因型對(duì)分娩方式的預(yù)測(cè) 采用二分類Logistic回歸分析評(píng)估年齡、孕前催產(chǎn)素受體基因型和產(chǎn)程中是否使用催產(chǎn)素對(duì)分娩方式的影響。最終得到的Logistic模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.974，P<0.000)，模型正確率88.7%，敏感度17.6%，特異度97.7%，陽性預(yù)測(cè)值50%，陰性預(yù)測(cè)值90.9%。繪制ROC曲線，AUC為0.820(95%CI0.700～0.940,P=0.000)，見圖1。將上述結(jié)果中P<0.05的3個(gè)變量

納入模型，年齡每增加1歲，以剖宮產(chǎn)分娩的風(fēng)險(xiǎn)增加27.9%(OR=1.279， 95%CI1.021～1.602 ，P=0.032)，催產(chǎn)素受體基因型“G”表型的孕婦以剖宮產(chǎn)分娩的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=3.633， 95%CI1.096～12.046，P=0.035)，催產(chǎn)素使用的產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)分娩的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=11.979， 95%CI3.456～41.529，P=0.000)，見表3。

圖1 不同因素預(yù)測(cè)分娩方式的ROC曲線

3 討 論

20世紀(jì)90年代開始，全球的剖宮產(chǎn)率逐漸升高，2009年美國(guó)的剖宮產(chǎn)率為32.9%，其中以“產(chǎn)程異?！睘槠蕦m產(chǎn)手術(shù)指征者占1/3，而“孕婦要求”的剖宮產(chǎn)只占3.0%，大多數(shù)人是由于“產(chǎn)程停滯”行剖宮產(chǎn)[4-5]。2018年我國(guó)的剖宮產(chǎn)率由2008年的28.8%上升至36.7%，但是在臨床中，產(chǎn)程可能并沒有“停滯”僅是慢于預(yù)期[1]，產(chǎn)程變慢會(huì)使剖宮產(chǎn)率增加。近年研究提示，不同個(gè)體進(jìn)入活躍期的起點(diǎn)均是不同的，若在臨床中特異性地分析每個(gè)患者的特點(diǎn)，可在一定程度上避免不必要的剖宮產(chǎn)手術(shù)。這就提出了從個(gè)體的內(nèi)在因素分析產(chǎn)程的啟動(dòng)及進(jìn)展。

催產(chǎn)素受體等子宮肌收縮相關(guān)蛋白與分娩的啟動(dòng)及發(fā)展息息相關(guān)，催產(chǎn)素受體在很多生理反射中起重要作用，例如平滑肌收縮、乳汁分泌及多種社會(huì)行為[6-7]。催產(chǎn)素受體受到物理(牽拉)和體液的調(diào)節(jié)，不僅是由類固醇激素水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄，盡管經(jīng)過多年的研究，催產(chǎn)素受體在人類分娩子宮空間和時(shí)間上的調(diào)控仍未探明。2017年Reinl等[8]發(fā)現(xiàn)3種催產(chǎn)素受體的變化，可以預(yù)測(cè)催產(chǎn)素受體功能的受損，在子宮肌層組織中缺乏催產(chǎn)素受體的患者，提示產(chǎn)程中需使用大劑量催產(chǎn)素以促進(jìn)產(chǎn)程進(jìn)展。2008年Henriksen等[9]關(guān)于難產(chǎn)的家族相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)了催產(chǎn)素基因和催產(chǎn)素受體基因的關(guān)聯(lián)，提示產(chǎn)程的進(jìn)展與遺傳因素相關(guān)，催產(chǎn)素及其受體基因可能為影響產(chǎn)程的內(nèi)在因素。

表3 不同因素對(duì)分娩方式影響的Logistic回歸分析

OXTR位于3p25～3p26上，rs53576為定位于第3個(gè)內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性[10]，分為AA/AG/GG 3種表型。在不同的人群中OXTR SNP不同。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫提供的歐洲人群rs53576 SNP的分布：A占35.57%，G占64.43%，東亞人群rs53576 SNP 的分布：A占66.5%，G占33.5%。Reiner等[11]選取美國(guó)18～22歲的人群進(jìn)行研究，其中42.9%為GG型，48.8%為AG型，8.3%為AA型。Rijlaarsdam等[12]對(duì)荷蘭人群進(jìn)行研究，42.4%為GG型，47.1%為AG型，10.5%為AA型。本研究發(fā)現(xiàn)，受試者中G占26.0%，A占74.0%，同NCBI數(shù)據(jù)庫中東亞人群的分布相似，表明本組人群OXTR rs53576基因型分布達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

2017年Grotegut等[13]發(fā)現(xiàn)OXTR基因差異與引產(chǎn)孕婦所需的催產(chǎn)素量、分娩時(shí)間和剖宮產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，“G”表型的產(chǎn)婦產(chǎn)程較慢，更多以剖宮產(chǎn)終止妊娠，Terkawi等[1]也發(fā)現(xiàn)在OXTR基因rs53576位點(diǎn)為“G”等位基因純合子的產(chǎn)婦進(jìn)入活躍期較其他基因型慢10%，導(dǎo)致總產(chǎn)程延長(zhǎng)近2 h。但目前研究結(jié)果不一，F(xiàn)eng等[14]有相反的結(jié)果，其發(fā)現(xiàn)OXTR rs53576位點(diǎn)“G”等位基因的個(gè)體使催產(chǎn)素受體表達(dá)增加，對(duì)催產(chǎn)素敏感，使產(chǎn)程更短。根據(jù)這些研究可以推斷OXTR基因型與產(chǎn)程的進(jìn)展高度相關(guān)，但在產(chǎn)程中的作用機(jī)制不明確。

催產(chǎn)素受體為子宮肌收縮相關(guān)蛋白，同催產(chǎn)素共同作用，促進(jìn)子宮收縮，妊娠期間催產(chǎn)素受體表達(dá)增加，并在分娩啟動(dòng)達(dá)到峰值，分娩期表達(dá)減少。推測(cè)不同OXTR基因型的催產(chǎn)素受體表達(dá)不同，其對(duì)催產(chǎn)素的敏感度相應(yīng)不一致，從而影響產(chǎn)程進(jìn)展。Spong等[4]發(fā)現(xiàn)OXTR rs53576“G”表型使催產(chǎn)素受體表達(dá)降低，功能受到抑制，子宮肌層組織中缺乏催產(chǎn)素受體的產(chǎn)婦，相應(yīng)的其催產(chǎn)素mRNA表達(dá)增加，此類患者在產(chǎn)程中需要額外添加催產(chǎn)素。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)程中使用催產(chǎn)素的孕婦以剖宮產(chǎn)為分娩結(jié)局的比率(28.6%)明顯高于未使用催產(chǎn)素孕婦(4.6%)，在建立的回歸模型分析中發(fā)現(xiàn)，催產(chǎn)素使用組剖宮產(chǎn)率的風(fēng)險(xiǎn)值明顯高于未使用組，推測(cè)產(chǎn)程中需外源性添加催產(chǎn)素的患者體內(nèi)催產(chǎn)素受體缺乏，影響子宮肌層收縮，從而影響產(chǎn)程進(jìn)展。針對(duì)陰道分娩的產(chǎn)婦分析，可看出OXTR rs53576“G”表型的產(chǎn)婦中82.75%(48/58)使用催產(chǎn)素，高于“A”表型產(chǎn)婦催產(chǎn)素使用率73.3%(55/75)，雖然并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍可看出OXTR“G”表型的產(chǎn)婦更需要使用催產(chǎn)素促進(jìn)產(chǎn)程進(jìn)展，可在后續(xù)的研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并檢測(cè)不同基因型產(chǎn)婦體內(nèi)催產(chǎn)素受體的表達(dá)。以期待是否可以根據(jù)產(chǎn)婦的基因型決定在產(chǎn)程中是否添加催產(chǎn)素，制定個(gè)性化的分娩方案。

研究發(fā)現(xiàn)，不同OXTR基因型在受體表達(dá)上的差異同基因的甲基化相關(guān)，不同片段的甲基化對(duì)于基因表達(dá)的影響是不同的[11]。5’-CpG-3′中胞嘧啶殘基的甲基化序列是哺乳動(dòng)物基因組的表觀遺傳修飾過程之一，與轉(zhuǎn)錄抑制，X染色體失活，印跡和寄生DNA序列表達(dá)的抑制有關(guān)。在哺乳動(dòng)物基因組中，有500～2 000個(gè)堿基對(duì)的CpG豐富片段，稱為CpG島。大多數(shù)CpG島的高甲基化會(huì)抑制該基因，而低甲基化則可以表達(dá)組織特異性基因。在催產(chǎn)素受體基因中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游140 bp至下游2 338 bp有一個(gè)CpG島，為非翻譯序列，可能有助于轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在肝臟細(xì)胞中，OXTR基因的甲基化降低其表達(dá)[12]，可以推測(cè)不同催產(chǎn)素受體基因表型個(gè)體的催產(chǎn)素受體表達(dá)差異與催產(chǎn)素受體基因的甲基化相關(guān)。2014年Dadds等[15]研究發(fā)現(xiàn)，OXTR啟動(dòng)子的甲基化可能會(huì)降低OXTR rs53576“G”表型的表達(dá)，抑制催產(chǎn)素受體表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在OXTR rs53576 “A”表型的個(gè)體中有明顯增加的基因甲基化，可降低OXTR rs53576“G”表型的表達(dá)，從而影響產(chǎn)程進(jìn)展。但也有研究指出催產(chǎn)素受體基因的甲基化同催產(chǎn)素基因表達(dá)是相互作用，但不是相加作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，“G”表型的產(chǎn)婦產(chǎn)程較慢，更多以剖宮產(chǎn)終止妊娠，可推測(cè)與不同基因型的甲基化相關(guān)，需進(jìn)一步的相關(guān)研究證明。

在此項(xiàng)研究中，不同分娩方式的新生兒體質(zhì)量無明顯差異，排除了因“巨大兒”導(dǎo)致“產(chǎn)程停滯”和孕產(chǎn)婦要求手術(shù)等因素的干擾。

人類分娩的機(jī)制目前仍不明確，但催產(chǎn)素和催產(chǎn)素受體起一定的作用，催產(chǎn)素受體基因表達(dá)的不同與分娩結(jié)局有關(guān)聯(lián)，OXTR SNP rs53576位點(diǎn)“G”表型可能同產(chǎn)程較慢相關(guān)，有此等位基因的產(chǎn)婦較多以剖宮產(chǎn)終止妊娠。提示未來臨床工作中可以根據(jù)催產(chǎn)素受體基因?yàn)槊课辉袐D制定個(gè)性化的分娩方案，為研究分娩啟動(dòng)及進(jìn)展的內(nèi)在機(jī)制提供了一個(gè)研究思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

呂青青：設(shè)計(jì)研究方案，收集整理臨床數(shù)據(jù)及標(biāo)本，論文撰寫；張洪影、丁楠、徐宇菲：完成試驗(yàn)實(shí)施過程；孫麗芳：提出研究思路，論文審核；鄂文：試驗(yàn)設(shè)計(jì)，基因檢測(cè)SNP標(biāo)記蛋白設(shè)計(jì)