基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討赤芍治療黃疸的作用機(jī)制*

李碩，李小科，葉永安

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所，北京100029

黃疸是由于膽紅素代謝障礙而致血清中膽紅素含量升高，繼而出現(xiàn)鞏膜、黏膜、皮膚發(fā)黃的一種癥狀和體征［1］，根據(jù)病因分為肝細(xì)胞性黃疸、溶血性黃疸、膽汁淤積性黃疸、遺傳性高結(jié)合膽紅素血癥、先天性非溶血性黃疸。黃疸常見于慢性肝炎、膽汁淤積性肝病或藥物性肝損傷患者。除了應(yīng)積極治療原發(fā)病及常規(guī)保肝治療外，黃疸患者臨床常用的退黃藥物如熊去氧膽酸、腺苷蛋氨酸、糖皮質(zhì)激素仍存在應(yīng)答不佳或不良反應(yīng)等問題。赤芍為臨床常用中藥，毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，其主要化學(xué)活性成分為芍藥總苷，尚含鞣質(zhì)類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分［2］。近年來，赤芍在黃疸中的運(yùn)用逐漸深入，但缺乏其活性成分、作用靶點(diǎn)及通路的研究。由此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘赤芍治療黃疸的主要成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，探討其功效作用網(wǎng)絡(luò)及藥效作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）；BATMANTCM平臺（http：／／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）；Uniport數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）；Gene-Cards（https：／／www.genecards.org／）；人類孟德爾遺傳數(shù) 據(jù)庫（OMIM，https：／／omim.org／）；disGeNET（https：／／www.disgenet.org／）；Therapeutic Target Database（TTD，http：／／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）；String數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org／）；Cytoscape軟件（version 3.7.1）；R軟件及安裝包c(diǎn)lusterProfiler（x64 version 3.6.1）［3］。

1.2 赤芍活性成分及潛在作用靶點(diǎn)篩選在TSMSP平臺中檢索“CHISHAO”，得到赤芍的所有化合物成分，將口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18設(shè)定為篩選條件，篩選出潛在活性成分。使用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物PubChem_CID，剔除未被PubChem收錄的化合物。利用BATMAN-TCM平臺預(yù)測候選活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，設(shè)置Score cutoff＞8，P value＜0.05，刪除無對應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分，利用Uniport數(shù)據(jù)庫中的Uni Pro KBt檢索功能校正基因名稱，刪除非人源靶點(diǎn)，獲得活性成分與潛在作用靶點(diǎn)相關(guān)信息。

1.3 黃疸靶點(diǎn)預(yù)測使用GeneCards、OMIM、dis-GeNET、TTD數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“jaundice”“hyperbilirubinemia”獲取黃疸相關(guān)的靶點(diǎn)，合并靶點(diǎn)基因并去除重復(fù)基因。

1.4 藥物有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將赤芍潛在活性靶點(diǎn)與黃疸潛在治療靶點(diǎn)匹配，得到交集靶點(diǎn)，使用韋恩圖表示交集靶點(diǎn)，并運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape軟件計(jì)算節(jié)點(diǎn)連接度（degree），明確赤芍較重要的有效成分。Degree值是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣髦抵唬硎九c某點(diǎn)連接的邊的數(shù)量，其值越大，表明該點(diǎn)在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中越重要。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將赤芍治療黃疸的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“homo sapiens”，閾值設(shè)置為中等置信度，隱藏游離靶點(diǎn)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果保存成TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件中MCODE插件進(jìn)行模塊化分析，設(shè)置degree cutoff＞2，K-Core為2，對其特征進(jìn)行分析，篩選核心靶標(biāo)模塊。

1.6 靶點(diǎn)GO分析和KEGG分析利用R軟件及clusterProfiler對赤芍治療黃疸的靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，設(shè)定閾值P＜0.05，顯示富集的前20位結(jié)果，通過生物學(xué)過程和信號通路富集分析預(yù)測赤芍治療黃疸的機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 赤芍主要有效成分篩選及潛在作用靶點(diǎn)收集TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到赤芍119個(gè)有效成分，符合篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）的有效成分共29個(gè)，將候選有效成分輸入PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物PubChem_CID，利用BATMAN-TCM平臺預(yù)測潛在作用靶點(diǎn)，去除13個(gè)PubChem未收錄的有效成分和2個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)Score＜8的有效成分，最終確定14個(gè)有效成分（見表1）。

運(yùn)用Uniport數(shù)據(jù)庫校正潛在作用靶點(diǎn)基因名，去除重復(fù)基因并刪除非人源靶點(diǎn)，最終得到赤芍潛在活性成分靶點(diǎn)228個(gè)。

表1 赤芍有效成分

2.2 黃疸靶點(diǎn)收集在GeneCard、OMIM、disGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“jaundice”“hyperbilirubinemia”，分別檢索到2036、15、55、1個(gè)靶點(diǎn)，合并所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)基因，共獲得與黃疸相關(guān)的靶點(diǎn)2 155個(gè)。

2.3 有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將赤芍潛在作用靶點(diǎn)與黃疸靶點(diǎn)匹配，得到交集靶點(diǎn)59個(gè)，繪制交集靶點(diǎn)韋恩圖（見圖1），推測赤芍可能通過這59個(gè)靶點(diǎn)對黃疸起到治療作用。

圖1 疾病與藥物靶點(diǎn)韋恩圖

運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建有效成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），圖中共包含73個(gè)節(jié)點(diǎn)，有效成分和潛在治療靶點(diǎn)相互作用關(guān)系為170條邊，運(yùn)用Cytoscape軟件計(jì)算有效成分degree值（即其作用的靶點(diǎn)數(shù)量），在赤芍有效成分中，潛在靶點(diǎn)數(shù)量排名前5位的是：β-谷甾醇（36個(gè)靶點(diǎn)）；豆甾醇（30個(gè)靶點(diǎn)）；菜油甾醇（29個(gè)靶點(diǎn)）；豆甾-4-烯-3-酮（16個(gè)靶點(diǎn)）；菠菜甾醇（16個(gè)靶點(diǎn)）。

圖2 赤芍有效成分-潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

細(xì)胞色素P4503A4（CYP3A4）和糖皮質(zhì)激素受體NR3C1與赤芍有效成分相互作用最為密切，分別被赤芍中7種有效成分調(diào)控；其次是雌激素受體ESR1和雄激素受體AR可以分別被6種赤芍有效成分調(diào)控。

說明藥物與靶點(diǎn)之間具有一藥多靶和一靶多藥的特點(diǎn)，提示赤芍通過多靶標(biāo)調(diào)控、多環(huán)節(jié)介入的模式發(fā)揮治療黃疸的作用。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將59個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲得相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，得到TSV文件后導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)繪制及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯ㄒ妶D3）。PPI網(wǎng)絡(luò)共包含55個(gè)節(jié)點(diǎn)（4個(gè)靶蛋白未參與相互作用），187條連接，degree值越大，其表現(xiàn)的圓形直徑越大；其中NR1H4（degree＝23）、AKT1（degree＝19）、CYP3A4（degree＝17）等靶蛋白degree值大，與其他靶蛋白相互作用強(qiáng)，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。利用Cytoscape軟件中MCODE插件進(jìn)行模塊化分析，設(shè)置degree cutoff＞2，K-Core為2，對其特征進(jìn)行分析，篩選出4個(gè)核心靶標(biāo)模塊（a、b、c、d），其聚類評分依次是4.889、4.909、3、3。篩選出來的模塊在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞效率更高，單一靶點(diǎn)對其他節(jié)點(diǎn)的影響力更大。

圖3 赤芍與黃疸交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG富集分析將赤芍治療黃疸的59個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)GeneRatio篩選出富集結(jié)果的前20位，并繪制氣泡圖（見圖4）。GO富集分析顯示，赤芍治療黃疸的作用機(jī)制與脂質(zhì)固化、類固醇代謝、脂質(zhì)運(yùn)輸、酒精代謝、有機(jī)羥基化合物生物合成、脂肪酸代謝、脂質(zhì)分解、次生酒精代謝、類固醇生物合成、類固醇結(jié)合、核受體活動、膽汁酸和膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過程相關(guān)。表明赤芍通過調(diào)節(jié)多種生物過程達(dá)到治療黃疸的作用。

圖4 赤芍治療黃疸靶點(diǎn)GO富集分析

將赤芍治療黃疸的靶點(diǎn)通過R軟件及cluster-Profiler進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)置閾值P＜0.05，并繪制氣泡圖（見圖5）。結(jié)果顯示赤芍治療黃疸的作用機(jī)制可能與膽汁分泌、非酒精性脂肪肝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂肪細(xì)胞因子信號通路、PPAR信號通路、膽固醇代謝等信號通路有關(guān)，表明赤芍潛在作用靶點(diǎn)可以通過多個(gè)通路干預(yù)黃疸。本研究發(fā)現(xiàn)較多靶點(diǎn)富集在膽汁合成及代謝通路，提示赤芍可能通過調(diào)控該通路及下游蛋白，如HMGCR、CYP3A4、RXRA等參與膽紅素代謝（見圖6）。

圖5 赤芍治療黃疸靶點(diǎn)KEGG富集分析

圖6 膽汁合成及代謝通路

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃疸是指因肝失疏泄，膽汁外溢，或血敗不華于色，引發(fā)以目黃、身黃、小便黃為主要臨床表現(xiàn)的病證［4］?！督饏T要略》提出黃疸病“從濕得之”，而唐容川《金匱要略淺注補(bǔ)正》云：“瘀熱以行，一個(gè)瘀字，便見黃皆發(fā)于血分，凡氣分熱不得稱瘀，小便黃赤短赤澀而不發(fā)黃者多矣……故必血分濕熱乃發(fā)黃也?！标P(guān)幼波先生提出“治黃必治血，血行黃易卻”的治療觀點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)應(yīng)從血分論治，在活血解毒化痰通絡(luò)基礎(chǔ)上辨證施治［5］。周仲瑛教授指出，瘀熱是指瘀和熱兩種病理因素互相搏結(jié)、膠結(jié)形成的具有新的特質(zhì)的病理因素，是黃疸的病理基礎(chǔ)［6］。說明歷代醫(yī)家對黃疸“瘀血發(fā)黃”的病機(jī)具有相似的觀點(diǎn)。赤芍清熱涼血，活血祛瘀，既入肝經(jīng)，兼入血分，對于治療黃疸具有較好療效?！侗静萁?jīng)疏》曰：“木芍藥色赤，赤者主破散，主通利，專入肝家血分……涼肝故通順血脈，肝主血，入肝行血，故散惡血，逐賊血……行血涼血?！苯陙?，中醫(yī)藥在治療黃疸方面的報(bào)道［7-8］不斷增加。何堂清等［9］對黃疸病常用處方數(shù)據(jù)挖掘進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)赤芍的使用頻次位于327種常用中藥中的第39位，提示了赤芍在治療黃疸病中的重要作用。臨床研究表明，赤芍對重度黃疸型肝炎患者血清膽紅素下降具有促進(jìn)作用［10-11］。茵陳蒿湯合赤芍湯治療急性黃疸型肝炎退黃、改善肝功能效果優(yōu)于使用門冬氨酸鉀鎂治療的對照組［12］。

本研究共篩選出赤芍14個(gè)主要有效成分。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇擁有相對較多的潛在靶點(diǎn)。上述三者均屬于植物甾醇，可以通過減弱炎癥模型下的細(xì)胞活力、降低吞噬能力以及NO、TNF-α的生成從而減輕炎癥反應(yīng)癥狀［13］。已有研究報(bào)道，β-谷甾醇及其衍生物對脂多糖／氨基半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用［14］。豆甾醇具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低膽固醇等藥理作用［15］。菠菜甾醇以濃度依賴性方式抑制脂多糖誘導(dǎo)的一氧化氮和促炎性細(xì)胞因子的生成［16-18］。

在篩選出治療黃疸的59個(gè)直接作用靶點(diǎn)中，CYP3A4、NR3C1與赤芍有效成分相互作用最為密切。CYP3A4是細(xì)胞色素P450家族中最為重要的藥物代謝酶，其在外源性物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用，50%以上的臨床口服藥物在體內(nèi)需經(jīng)CYP3A4的代謝轉(zhuǎn)化［19］。藥物經(jīng)過細(xì)胞色素P450代謝亦可形成如電子基、氧自由基等有害活性毒物，毒物形成與解毒之間的平衡對藥物性肝損傷的形成至關(guān)重要［20］，故通過調(diào)控CYP3A4可從加強(qiáng)藥物解毒、代謝的角度改善藥物性肝損傷引起的黃疸。NR3C1基因調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體。糖皮質(zhì)激素是一種廣譜免疫抑制劑，其消退黃疸的主要機(jī)制是：減輕門脈區(qū)和毛細(xì)膽管的非特異性炎癥；利于膽汁的排泌，改善全身毒性反應(yīng)；阻止抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生；減少肝細(xì)胞免疫損傷；穩(wěn)定溶酶體膜；減少組織損害；減少血紅蛋白分解；減少膽紅素生成［21］。糖皮質(zhì)激素可通過阻止細(xì)胞因子的產(chǎn)生和黏附分子的表達(dá)而限制T淋巴細(xì)胞的活化，同時(shí)可選擇性抑制B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體［22］，充分權(quán)衡治療收益和不良反應(yīng)后可應(yīng)用于免疫機(jī)制介導(dǎo)的膽汁淤積患者，如自身免疫性肝炎、乙型病毒性肝炎等。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)果顯示，NR1H4在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，與其他靶蛋白相互作用強(qiáng)。NR1H4基因編碼膽汁酸受體法尼酯衍生物X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）通過調(diào)節(jié)參與膽汁酸的合成及肝腸循環(huán)維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)。FXR途徑參與膽汁淤積的形成和管理，而FXR激活療法對膽汁淤積具有直接治療作用［23］。對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，獲得其中聚類評分較高的4個(gè)模塊，其中聚類評分最高的模塊b中包含ABCB1、ABCC2、SLCO1B3、FABP6、GPBAR1、NFKB1、NR1I2等膽紅素代謝相關(guān)靶點(diǎn)，提示可能通過調(diào)節(jié)膽紅素代謝發(fā)揮治療黃疸的作用。

赤芍治療黃疸通路富集分析結(jié)果顯示，赤芍通過多條通路發(fā)揮治療黃疸的作用，如膽汁分泌、ATP結(jié)合盒式（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、PPAR信號通路等。

保證膽汁的正常分泌及代謝在治療膽汁淤積性黃疸中尤為重要。膽紅素從肝細(xì)胞分泌至膽小管，再隨膽汁進(jìn)入腸道完成肝腸循環(huán)，若膽汁排泄出現(xiàn)障礙，膽紅素反流入血，導(dǎo)致血清膽紅素水平升高。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?，參與細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞毒性化合物排出［24］，其成員的功能正常，保證膽汁的正常運(yùn)輸，從而避免膽汁淤積疾病的發(fā)生，如由ABCB11基因編碼的膽汁酸外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)功能正常，保證了膽汁酸在體內(nèi)的平衡［25］，ABCC2基因異常則會導(dǎo)致結(jié)合膽紅素在肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄障礙，出現(xiàn)以黃疸為主要特征的Dubin-Johnson綜合征［26］。研究表明，激活小鼠的孕烷X受體（pregnane X Receptor，PXR）能增加膽紅素的清除［27］。PXR作為膽紅素代謝轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子，通過誘導(dǎo)UGT1A1基因表達(dá)來影響膽紅素代謝消除［28］。另一方面，PXR參與調(diào)控藥物代謝酶CYP3A4［29］的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肝臟的解毒和代謝功能以緩解黃疸。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα）激活可調(diào)節(jié)膽固醇代謝并抑制膽汁酸的合成。一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)表明，激活PPARα后，可顯著降低血清膽紅素水平、減少炎癥因子，從而改善肝細(xì)胞損傷［30］。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法系統(tǒng)預(yù)測了赤芍治療黃疸的機(jī)制，通過對赤芍的有效成分、潛在靶點(diǎn)及生物學(xué)功能和作用通路綜合分析，發(fā)現(xiàn)赤芍主要通過增加膽汁分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)、提高藥物代謝酶含量、調(diào)控核受體活性、抑制炎性因子釋放等方面治療黃疸。由此預(yù)測，運(yùn)用赤芍治療膽汁淤積性黃疸或藥物性肝損傷、炎癥引起的肝細(xì)胞性黃疸可能取得較好療效，但仍需完善動物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證，以提高臨床用藥的合理性和科學(xué)性。