基于GRP78-ATF6-CHOP通路研究雷公藤多苷對壞死性小腸結(jié)腸炎新生大鼠的影響*

高鵬，周鳳蕊，劉俊華，周川

1.鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州450015；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是臨床常見的新生兒急重癥，尤其是早產(chǎn)兒、低體質(zhì)量兒發(fā)病率更高，已成為導(dǎo)致新生兒死亡的重要疾病之一［1-3］。NEC以小腸、結(jié)腸彌漫性或局部壞死為典型特征，至今尚無有效的治療手段，探討其發(fā)病機(jī)制，尋找有效干預(yù)手段對改善NEC預(yù)后有重要臨床意義。研究表明，除腸道菌群紊亂外，腸道促炎及抗炎因子失衡與NEC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［4-5］。隨著對中醫(yī)藥研究的深入，發(fā)現(xiàn)中藥在抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面發(fā)揮著重要作用。雷公藤是臨床常用的活血化瘀、解毒消腫藥物，其主要活性成分雷公藤多苷已被證實(shí)具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用［6-8］。雷公藤多苷常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病［9-10］，但其對NEC的研究較少。本研究應(yīng)用新生大鼠人工喂養(yǎng)聯(lián)合缺氧冷刺激的方法建立NEC模型，觀察不同劑量的雷公藤多苷對其腸道菌群的影響，并探討具體的調(diào)控機(jī)制，為臨床新生兒NEC的治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物SPF級SD新生大鼠55只，雌雄不限，1～2日齡，體質(zhì)量5～10 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（豫）2018-0001。飼養(yǎng)于12 h／12 h明暗交替，24～26℃，相對濕度（55±1）%條件下。實(shí)驗(yàn)操作符合動物倫理學(xué)，倫理號：2019005703127。

1.2 藥物及試劑雷公藤多苷片（江蘇美通制藥有限公司，批號：20190320）；雅培嬰兒配方奶粉、雅培蛋白粉（美國雅培公司，批號分別為：57713T26、61485C15）；脂肪乳（德國費(fèi)森尤斯卡比華瑞制藥有限公司，批號：20203927）；白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R＆D公司，批號分別為：VAL601、M600B、ML-Elisa-1421）；BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo公司，批號：23209）；兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）單抗、兔抗大鼠激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）多抗、兔抗大鼠增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）單抗（美國Abcam公司，批號分別為：ab21685、ab203119、ab194533）；山羊抗兔GRP78、ATF6、CHOP單抗（美國Abcam公司，批號分別為ab227865、ab37149、ab265760）。

1.3 儀器SM2235型徠卡切片機(jī)（德國徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司），3550UV型酶標(biāo)儀、Powerpac Universal通用型電泳儀（美國Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 NEC模型建立取55只新生大鼠，出生48 h后與母鼠分離，放置保育箱中，給予配方奶（雅培嬰兒配方奶粉4.741 g+雅培蛋白粉9.5 g+200 g·L-1的脂肪乳48.8 mL，雙蒸水補(bǔ)充至100 mL）喂養(yǎng)。首次給予0.2 mL，每3 h給予1次，隨后每24 h增加0.1 mL，連續(xù)喂養(yǎng)3 d。隨機(jī)選取45只新生大鼠每天早晚人工喂養(yǎng)后給予缺氧+冷刺激［11］：新生鼠放入自制缺氧箱，控制N2流量為15 L·min-1，測氧儀顯示O2濃度為0時開始計時，維持90 s后關(guān)閉輸N2閥門，立即取出新生鼠，放置于4℃冰箱中，持續(xù)10 min，連續(xù)3 d，每天2次。以排黃綠色黏液稀便、體質(zhì)量減輕為造模成功標(biāo)志。10只新生大鼠僅母鼠分離、人工喂養(yǎng)，不作缺氧+冷刺激。

2.2 動物分組及干預(yù)取造模成功大鼠38只，采用體質(zhì)量排序法隨機(jī)分為4組，分為模型組9只、雷公藤多苷低劑量組9只、雷公藤多苷中劑量組10只，雷公藤多苷高劑量組10只；另10只僅母鼠分離、人工喂養(yǎng)的新生大鼠，設(shè)為對照組。造模結(jié)束次日，給予雷公藤多苷低劑量組、中、高劑量組新生大鼠分別灌胃9 mg·kg-1、18 mg·kg-1、27 mg·kg-1的雷公藤多苷片混懸液（灌胃前用生理鹽水配制為0.1 mL的混懸液），其中雷公藤多苷劑量是按照人與大鼠體表面積換算的等效劑量［12］，對照組和模型組灌胃0.1 mL的生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

2.3 標(biāo)本采集末次灌胃結(jié)束后禁食12 h期間留取各組糞便樣本1 g進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查；禁食12 h后，脫頸法處死各組新生大鼠，立即剖腹取回盲部近端腸管約2 cm，PBS沖洗干凈后隨機(jī)分為兩部分，一部分置于4%的中性甲醛中固定備用，另一部分儲存于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 腸道組織病理學(xué)檢查取固定于4%的中性甲醛中的腸道組織，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度為4μm的連續(xù)切片，取切片進(jìn)行脫蠟、水化步驟，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變，并采用雙盲法進(jìn)行腸組織損傷評分［11］：腸絨毛膜及組織結(jié)構(gòu)正常，記0分；黏膜下和（或）固有層輕度分離，記1分；黏膜下和（或）固有層中度分離，黏膜下和（或）固有層水腫，記2分；黏膜下和（或）固有層重度分離，黏膜下和（或）固有層水腫，局部腸絨毛膜脫落，記3分；腸絨毛膜完全脫落且伴腸壞死，記4分。每張切片隨機(jī)取3個視野評分，取平均值。

2.5 腸道菌群分析取各組糞便樣本，稀釋液1∶10進(jìn)行稀釋，在無菌玻璃片上均勻涂布1 cm×1 cm區(qū)域，自然晾干后，在酒精燈上烤片固定，進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色［13］，于光學(xué)顯微鏡下（10×100倍）對細(xì)菌總數(shù)、革蘭氏陽性（G+）桿菌、革蘭氏陰性（G-）桿菌、G+球菌、G-球菌進(jìn)行計數(shù)，每張切片隨機(jī)取3個視野計數(shù)，取平均值。

2.6 檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平取儲存于液氮中的腸組織50 mg，加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.0），剪碎后進(jìn)行超聲勻漿，4℃離心半徑12 cm，2 500 r·min-1離心15 min，取組織上清液，采用ELISA檢測腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按照說明書步驟進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀上檢測待測樣本光密度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣本濃度。

2.7 GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量的檢測取儲存于液氮中的腸組織50 mg，液氮中研磨，轉(zhuǎn)移至離心管，加入1 mL的組織裂解液，冰上孵育30 min，4℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，采用BCA法測定總蛋白量。取50μg樣本進(jìn)行SDS-PAGE，電泳分離后，將條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液室溫封閉2 h，均加入1∶500稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，暗室中顯色。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageJ軟件分析各條帶灰度值，計算GRP78、ATF6、CHOP條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 新生大鼠一般情況對照組新生大鼠進(jìn)奶量、排便、活動情況等均正常，試驗(yàn)期間無死亡；模型組新生大鼠出現(xiàn)進(jìn)奶量減少、消瘦、懶動、反應(yīng)遲鈍、腹脹、腹瀉、排黃綠色黏液稀便等情況；雷公藤多苷各劑量組上述情況均有所改善，且雷公藤多苷高劑量組改善最為明顯。

3.2 腸組織病理學(xué)觀察及組織損傷評分比較對照組大鼠腸黏膜上皮連續(xù)、完整，結(jié)構(gòu)正常；模型組絨毛水腫、脫落、結(jié)構(gòu)消失，固有層及黏膜下層大量炎性細(xì)胞浸潤；雷公藤多苷各劑量組絨毛水腫、脫落現(xiàn)象減輕，結(jié)構(gòu)趨于正常，炎性細(xì)胞浸潤量減少，雷公藤多苷高劑量組上述病變最輕，但仍有少量炎性細(xì)胞浸潤。對照組、模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組腸組織損傷評分分別為（0.41±0.08）分、（3.20±0.62）分、（2.51±0.42）分、（2.15±0.34）分、（1.67±0.21）分，與對照組比較，模型組腸組織損傷評分均升高（t＝14.145，P＜0.001）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中及高劑量組腸組織損傷評分均降低（t＝2.764、5.087、7.368，P＝0.014、＜0.001、＜0.001）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組腸組織損傷評分均降低（t＝2.636、5.606，P＝0.017、＜0.001），且雷公藤多苷高劑量組低于中劑量組（t＝3.007，P＝0.008）。見圖1。

3.3 腸桿菌總數(shù)、腸球菌總數(shù)及桿／球菌比值比較與對照組比較，模型組腸桿菌總數(shù)、桿／球菌比值降低，腸球菌總數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組腸桿菌總數(shù)、桿／球菌比值升高，腸球菌總數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組腸桿菌總數(shù)、桿／球菌比值升高，腸球菌總數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組腸桿菌總數(shù)、桿／球菌比值升高，腸球菌總數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 腸組織病理學(xué)觀察（HE，×200）

表1 腸桿菌總數(shù)、腸球菌總數(shù)及桿／球菌比值比較 （±s）

表1 腸桿菌總數(shù)、腸球菌總數(shù)及桿／球菌比值比較 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n 腸桿菌總數(shù)／個 腸球菌總數(shù)／個 桿／球菌比值對照組10 181.59±17.36 65.70±7.31 2.76±0.24 模型組9 110.44±9.58*205.38±19.88*0.54±0.08*雷公藤多苷低劑量組 9 125.27±13.07＃ 180.01±19.20＃0.70±0.09＃雷公藤多苷中劑量組 10 141.08±14.22?！?158.36±17.35?！?.89±0.11?！骼坠俣嘬崭邉┝拷M 10 156.31±15.94?！鳌?22.47±15.32＃△▲ 1.28±0.16＃△▲F值34.980 106.974 346.237 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.4 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數(shù)比率比較與對照組比較，模型組G+桿菌比率明顯降低，G+球菌比率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組G+桿菌比率明顯升高，G+球菌比率明顯降低（P＜0.05）。見表2。

3.5 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較與對照組比較，模型組IL-6水平明顯降低，IL-1β、TNF-α明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷中劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組IL-6水平明顯升高，IL-1β、TNF-α明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表2 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數(shù)比率比較 （±s，%）

表2 腸道G+桿菌、G+球菌占總菌群數(shù)比率比較 （±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n G+桿菌比率G+球菌比率對照組10 60.54±5.97 19.36±2.07模型組9 29.88±3.51*51.20±5.22*雷公藤多苷低劑量組 9 35.30±4.10＃44.54±4.35＃雷公藤多苷中劑量組10 41.26±5.11?！?6.83±3.16＃△雷公藤多苷高劑量組10 49.55±5.24?！鳌?0.17±3.22＃△▲F值58.023 106.410 P值＜0.001＜0.001

表3 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 （±s，ng·L-1）

表3 腸組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 （±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

組別n IL-1βIL-6 TNF-α對照組10 52.33±7.21 105.91±8.30 26.15±6.77 模型組9 262.07±20.66*26.32±3.11*315.49±21.83*雷公藤多苷低劑量組9 201.54±18.73＃51.64±6.54＃231.02±20.26＃雷公藤多苷中劑量組 10 168.78±15.21?！?0.27±6.34?！?75.10±19.37＃△雷公藤多苷高劑量組 10 131.19±15.09?！鳌?2.33±6.75?！鳌?4.37±10.22?！鳌鳩值232.762 193.150 442.447 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.6 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量比較與對照組比較，模型組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05），且雷公藤多苷中劑量組低于高劑量組。見表4，圖2。

表4 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與雷公藤多苷低劑量組比較，△P＜0.05；與雷公藤多苷中劑量組比較，▲P＜0.05

GRP78 ATF6 CHOP對照組組別n 10 0.41±0.06 0.38±0.04 0.14±0.03 模型組9 2.06±0.18*1.49±0.12*1.35±0.16*雷公藤多苷低劑量組 9 1.11±0.11＃1.10±0.11＃1.13±0.12＃雷公藤多苷中劑量組 10 0.85±0.09?！?.83±0.08?！?.92±0.08?！骼坠俣嘬崭邉┝拷M 10 0.62±0.07?！鳌?.60±0.07?！鳌?0.65±0.09?！鳌鳩值326.753 231.944 197.043 P值 ＜0.001＜0.001＜0.001

圖2 腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白表達(dá)

4 討論

NEC是新生兒危重癥，多在出生后3周內(nèi)發(fā)病，以腸道局部壞死為臨床特征，易導(dǎo)致腸穿孔［14］。外科手術(shù)結(jié)合常規(guī)對癥治療是主要干預(yù)手段，但治療效果仍需進(jìn)一步提高［15-16］。目前NEC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為與早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、腸道菌群紊亂等多種因素有關(guān)，闡明NEC發(fā)病機(jī)制并尋找有效治療方法有重要意義［17-18］。雷公藤多苷是中藥雷公藤的有效活性成分，可通過調(diào)節(jié)體液免疫、細(xì)胞免疫參與機(jī)體炎癥反應(yīng)［19］。研究雷公藤多苷對NEC新生大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制，可為雷公藤多苷進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

臨床中手術(shù)切除的新生兒腸道組織標(biāo)本，因伴有嚴(yán)重壞死及非特異性炎癥病變，不適合對疾病早期病變的研究［20］。人工喂養(yǎng)聯(lián)合缺氧冷刺激復(fù)制NEC模型，其腸道損傷病理改變過程與人類相似［21］，本研究應(yīng)用該方法建立NEC新生大鼠模型。結(jié)果顯示造模大鼠出現(xiàn)腹脹、腹瀉、排黃綠色黏液稀便等NEC典型癥狀，腸道病理改變與臨床相似。機(jī)體腸道菌群多種多樣，如雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等G+桿菌等生理性優(yōu)勢菌群，腸球菌、鏈球菌等G+球菌及擬桿菌、大腸埃希菌等G-桿菌，屬條件致病菌，另外葡萄球菌、假單胞菌等多屬于G-桿菌和G+球菌，屬有害病原菌［22-23］。胎兒腸道無菌，新生兒在出生數(shù)小時內(nèi)腸道細(xì)菌迅速定植和生長，達(dá)到平衡狀態(tài)，使桿球菌比值維持在3左右，喂養(yǎng)方式、缺氧、寒冷等刺激因素均可引起腸道菌群定植紊亂［24］。本研究中模型組腸道桿球菌比值約0.54，優(yōu)勢菌群G+桿菌比率降低、條件致病菌或病原菌G+球菌比率升高，應(yīng)用不同劑量雷公藤干預(yù)后桿球菌比值、G+桿菌比率均得到顯著提高，G+球菌比率降低，提示NEC新生大鼠的腸道菌群紊亂現(xiàn)象得到糾正。此外，本研究應(yīng)用不同劑量雷公藤多苷干預(yù)后，各干預(yù)組較模型組腸組織損傷評分、腸組織IL-1β、TNF-α水平呈劑量依賴性降低，而腸組織IL-6水平呈劑量依賴性升高，說明雷公藤多苷有助于調(diào)節(jié)NEC新生大鼠的腸道炎癥反應(yīng)。研究顯示，腸道菌群紊亂后，條件致病菌及病原菌產(chǎn)生的毒素可引起黏膜完整性破壞、炎癥細(xì)胞浸潤等一系列病理改變，腸道發(fā)生嚴(yán)重炎癥病變［25］。艾燕等［26］研究表明，雷公藤多苷可通過抑制腸組織中TNF-α等促炎因子水平發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)作用；欽丹萍等［27］研究顯示，雷公藤多苷可有效緩解克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)果相似。NEC發(fā)病后腸黏膜完整性被破壞，病原菌異位，引起內(nèi)源性促炎介質(zhì)大量釋放，雷公藤通過抑制促炎介質(zhì)釋放，促進(jìn)抗炎介質(zhì)分泌，發(fā)揮保護(hù)腸黏膜完整性作用。

本研究中，雷公藤多苷各劑量組腸組織中GRP78、ATF6、CHOP蛋白相對表達(dá)量呈劑量依賴性降低，說明雷公藤多苷可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路發(fā)揮調(diào)控作用。GRP78是主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的熱休克蛋白，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ESR）穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)［28］。生理狀態(tài)下，GRP78與下游ATF6結(jié)合處于非激活狀態(tài)，當(dāng)ESR啟動后，兩者發(fā)生解離，ATF6隨之活化進(jìn)入細(xì)胞核，激活位于下游的靶基因CHOP轉(zhuǎn)錄和翻譯，啟動細(xì)胞凋亡等過程［29］。喂養(yǎng)不當(dāng)、缺氧等多種高危因素作用下，腸道ESR增加，GRP78-ATF6-CHOP通路激活，從而啟動細(xì)胞凋亡通路，加之腸道微生態(tài)失衡釋放大量腸毒素，進(jìn)一步加劇腸道上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腸組織損傷［30］。由此可知，雷公藤多苷可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路，緩解腸組織上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，從而發(fā)揮保護(hù)NEC腸組織作用。

綜上所述，雷公藤多苷可有效改善NEC新生大鼠的腸道菌群紊亂現(xiàn)象，且可能通過抑制GRP78-ATF6-CHOP通路發(fā)揮保護(hù)腸組織的作用，為臨床雷公藤多苷用于NEC的防治提供理論參考。