通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及炎癥因子的影響

馬紅靜，馬民凱，馬紅建，陳新苗，侯冰潔

(保定市第四中心醫(yī)院，河北 保定 072350)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由環(huán)境、遺傳和自身免疫等多種致病因素導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)代謝紊亂，胰島素分泌缺陷或功能障礙引發(fā)胰島素抵抗和缺乏，主要以血糖持續(xù)處于高水平狀態(tài)為特征的臨床綜合征[1]。2型糖尿病病因復(fù)雜，患者由胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，血漿胰島素水平可正?；蛏撸ǔ？刹灰蕾囈葝u素治療，多數(shù)患者可進(jìn)行系統(tǒng)管理模式治療，如醫(yī)學(xué)營養(yǎng)治療、規(guī)律的運(yùn)動(dòng)治療及藥物治療等綜合治療，有助于控制血糖水平[2]。此型糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，有報(bào)道稱[3-4]，2型糖尿病的發(fā)生與遺傳因素和環(huán)境因素關(guān)系密切，可影響胰島功能的發(fā)揮，以胰島素抵抗為主，出現(xiàn)一系列感染炎癥性表現(xiàn)及代謝紊亂，可并發(fā)復(fù)雜性并發(fā)癥。近年來，有關(guān)中醫(yī)藥治療糖尿病的基礎(chǔ)研究和臨床報(bào)道越來越多，關(guān)于中藥及其復(fù)方治療糖尿病的機(jī)制研究亦不斷深入。目前，中醫(yī)藥治療糖尿病取得較為顯著的療效，對(duì)于抑制炎癥反應(yīng)、提高免疫功能及改善胰島素功能體現(xiàn)了明顯的效果，對(duì)糖尿病的治療提供了有效的思路。本研究以中藥復(fù)方通絡(luò)散結(jié)湯為研究對(duì)象，對(duì)灌胃給予通絡(luò)散結(jié)湯的2型糖尿病大鼠血及脾臟組織中炎癥因子及T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，闡明了通絡(luò)散結(jié)湯治療該病的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠50只，體重(190±10)g，雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2002-0006]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、藥物及試劑 藥物：通絡(luò)散結(jié)湯(黃芪40 g，生地黃15 g，黨參、當(dāng)歸、夏枯草、僵蠶各10 g,丹參、牡蠣各20 g，川芎12 g，地龍5 g，水蛭粉1 g，甘草6 g) ，把上述藥味采用常規(guī)水煎煮方法，以10倍量藥材的水浸泡30 h，先大火煮沸以后小火繼續(xù)煎煮1 h，過濾取濾液，殘?jiān)偌尤?0倍量的水煎 30 min，再過濾，合并兩次濾液，濃縮至1 g(生藥材)/ml。試劑：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購于北京索萊寶公司；實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清各炎癥因子指標(biāo)所需試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)CD4+、CD8+所需ELISA試劑盒，均購自上海西唐生物科技有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，購自美國Thermo公司；TNF-α抗體、IL-6抗體、CRP抗體、β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購自杭州弗德生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜，購自美國Millipoer公司。儀器：G-421-1型血糖儀購置愛奧樂醫(yī)療器械有限公司；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀(上海美谷分子)；H1650R臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 SD大鼠50只，體重(190±10)g，均于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組，即正常對(duì)照組(M組)10只和高脂高糖飼料組40只。造模方法：M組大鼠持續(xù)予SPF級(jí)飼料喂養(yǎng)，其余造模組大鼠均給予高糖高脂高營養(yǎng)飼料(高糖高脂飼料配比為：豬油16.5%，白糖20%，膽酸鈉1.5%，膽固醇2%，高營養(yǎng)飼料60%)喂養(yǎng)，連續(xù)8周。8周后，禁食12 h，高脂高糖飼料組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(60 mg/kg)，M組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)72 h，依據(jù)大鼠空腹血糖即尾靜脈血糖≥16.7 mmol/L為判定造模成功標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，共篩選糖尿病模型大鼠30只，分為：模型對(duì)照組(N組)10只；通絡(luò)散結(jié)湯高劑量組(S組)10只、低劑量組(T組)10只。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 通絡(luò)散結(jié)湯大鼠用藥劑量根據(jù)《中藥藥理方法學(xué)》人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量以及高、低劑量計(jì)算法確定。S組(10 g/kg，按生藥材量計(jì))、T組(5 g/kg)組，采用灌胃途徑按照各組藥物劑量給藥，N組和M組予等體積生理鹽水代替灌胃，每天2次，連續(xù)2周，期間各組大鼠正常飲食。

1.5 取材及檢測(cè)指標(biāo) 灌胃給藥結(jié)束后，各組大鼠均禁食12 h，可不禁水，于大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)使其麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血，常溫靜置2 h于4 ℃離心，離心后取上清液用于檢測(cè)血清(Fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)、TC、TG、TNF-α、IL-6、CRP、CD4+、CD8+等濃度。隨后于實(shí)驗(yàn)室解剖臺(tái)上快速摘取大鼠脾臟，用生理鹽水進(jìn)行沖洗，吸干水分，液氮中保存，用于Western blotting法檢測(cè)，步驟如下：取處理好的脾臟組織，混入組織裂解液，震蕩裂解為看不見的顆粒，離心提取蛋白，于沸水中煮沸10 min，冷卻離心后取上清液加入制備好的凝膠，放入槽內(nèi)進(jìn)行電泳，浸入轉(zhuǎn)膜液中轉(zhuǎn)膜，后放入盛有配好的牛奶的器皿中室溫封閉過夜，稀釋適當(dāng)比例的一抗稀釋液(CD4+、CD8+、β-actin均為1∶1000)室溫孵育2 h，取PVDF膜浸入稀釋后的辣根酶標(biāo)記的二抗(稀釋濃度為1∶5000)溶液室溫孵育1 h，最后掃膜壓片成像并進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果以目的蛋白灰度值(β-actin)灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影響 見表1。與M組比較，N組大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均顯著升高(P<0.05)；與N組比較，S組、T組大鼠血清中FBG、TC、TG等血糖及血脂水平均顯著降低(P<0.05)。

表1 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血糖血脂水平的影響(mmol/L)

2.2 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子濃度的影響 見表2。與M組比較，N組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP濃度均顯著升高(P<0.05)；與N組比較，S組、T組大鼠血清中TNF-α、IL-6、CRP濃度均顯著降低(P<0.05)。

表2 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血清中炎癥因子濃度的影響

2.3 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響 見表3。與M組比較，N組大鼠血清中CD4+T淋巴細(xì)胞濃度顯著升高(P<0.05)，CD8+濃度均顯著降低(P<0.05)，CD4+/CD8+比值顯著升高；與N組相比，S、T組CD8+濃度顯著升高(P<0.05)，CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.05)。

表3 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠血清中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)的影響

2.4 通絡(luò)散結(jié)湯對(duì)2型糖尿病大鼠脾臟組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 與M組比較，N組大鼠組織中CD4+濃度顯著升高，CD8+濃度顯著降低(P<0.05)；與N組比較，S組、T組D4+水平均顯著降低(P<0.05)，CD8+水平均顯著升高(P<0.05)。見圖1。

注：與M組比較，*P<0.05；與N組比較，#P<0.05

3 討 論

中醫(yī)方面，糖尿病可歸屬于“消渴病”范疇，消渴病屬于慢性病，部分患者可發(fā)展為醫(yī)“消渴病心病”“消渴病腎病”。其主要病因病機(jī)為：飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞力損傷等導(dǎo)致氣血陰陽失調(diào)，導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰濁、寒凝等痹阻心脈與腎絡(luò)，血瘀氣滯，脈絡(luò)不通，心陽腎陽不足，故疲倦乏力，血瘀氣滯，脈絡(luò)不通。基于此理論，消渴病實(shí)屬本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以心脾腎虧虛為主，標(biāo)實(shí)指痰濁、水濕、瘀血、毒邪等，宜以補(bǔ)虛扶弱、活血化瘀為臨床治則之一[6]。本研究中所用方劑由黃芪、黨參、生地黃、當(dāng)歸、丹參、川芎、地龍、水蛭、牡蠣、夏枯草、僵蠶、甘草組成，具有益氣養(yǎng)陰、通絡(luò)散結(jié)的功效。現(xiàn)代藥理研究證明，方中諸多藥味均具有調(diào)節(jié)血糖水平和改善血液流變學(xué)特征作用，黃芪可有效降低T2DM大鼠血糖水平，降低炎癥因子釋放，調(diào)控炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，控制T2DM的進(jìn)展[7]；生地黃對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖自身平衡有顯著作用，另外還可調(diào)節(jié)腸道菌群，使機(jī)體內(nèi)各種菌群處于平衡狀態(tài)[8]；丹參能改善微循環(huán)，加快血液流速、增加血流量作用[9]；水蛭可通過和凝血酶的直接結(jié)合而發(fā)揮抗凝抗凝、抗栓、纖溶作用[10]；牡蠣除具有降糖作用外，對(duì)四氧嘧啶所致的小鼠胰腺細(xì)胞也有一定的保護(hù)作用[11]。

T淋巴細(xì)胞是由人體多能干細(xì)胞分化而來，經(jīng)血液循環(huán)分布至各免疫器官，其數(shù)量穩(wěn)定且比值保持動(dòng)態(tài)平衡，通過血液及淋巴管等再循環(huán)，發(fā)揮有效的免疫調(diào)節(jié)功能，維持機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡。CD4+是一種標(biāo)志性輔助性T細(xì)胞，可輔助并調(diào)控其他淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)；CD8+是一種標(biāo)志性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，可殺滅受到感染的細(xì)胞，維持機(jī)體免疫應(yīng)答，機(jī)體的免疫功能可用CD4+/CD8+來表示，其比值高低代表機(jī)體免疫機(jī)能的強(qiáng)弱，二者成正比關(guān)系[3]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，2型糖尿病患者血糖持續(xù)處于高水平狀態(tài)，影響機(jī)體T淋巴細(xì)胞的成熟、分化及功能，使其總數(shù)下降，CD4+/CD8+失調(diào)，降低CD4+T淋巴細(xì)胞增殖、釋放，抑制其免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，促進(jìn)胰島β細(xì)胞損傷，胰島功能障礙，產(chǎn)生抗體，或分泌胰島素失衡，出現(xiàn)胰島素抵抗，加重糖尿病的進(jìn)展[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與M組相比較，N組大鼠血清炎性因子CD4+濃度顯著升高，CD8+濃度顯著降低，與N組相比較，S組、T組大鼠血清炎性因子CD4+濃度均顯著降低，CD8+濃度顯著升高，表明糖尿病大鼠細(xì)胞免疫功能降低，通絡(luò)散結(jié)湯可糾正糖尿病大鼠免疫失控狀態(tài)，改善細(xì)胞免疫功能。

糖尿病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚不十分明確，目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)炎癥學(xué)說參與其發(fā)病[12]。研究表明，2型糖尿病患者由于持續(xù)高血糖水平可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，屬于慢性炎癥性疾病[13-14]。炎癥因子可作為始動(dòng)因素，與胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切，大量炎癥因子通過抑制其磷酸化，減少胰島素受體，阻礙葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，降低胰島素效應(yīng)，發(fā)生高胰島素血癥。此外，機(jī)體處于炎癥環(huán)境下，異常表達(dá)的炎癥因子可作用于胰島素信號(hào)通路，干擾并抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)胰島素抵抗[15]。炎癥因子中，與糖尿病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的指標(biāo)為TNF-α、IL-6、CRP，TNF-α是由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的一種蛋白，可激活和刺激其他炎癥因子的分泌，產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，其信號(hào)傳導(dǎo)活躍，干擾胰島細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路；CRP是一種炎癥性蛋白質(zhì)，介導(dǎo)NF-κB產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促使炎癥因子的合成、釋放，進(jìn)一步加重胰島素抵抗，代謝功能紊亂，致使內(nèi)皮細(xì)胞受損，誘發(fā)轉(zhuǎn)移抑制因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[16]； IL-6是由活化的成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，功能廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫和促進(jìn)炎癥反應(yīng)作用，能夠溶解脂肪細(xì)胞，損傷胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致其凋亡，從而降低胰島素受體數(shù)目，抑制糖、脂肪代謝，進(jìn)而使胰島素信號(hào)通路受到阻礙，導(dǎo)致胰島素抵抗[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與M組相比較，N組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯升高，與N組相比較，S組、T組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP水平均明顯降低，表明處于高血糖水平的2型糖尿病大鼠體內(nèi)存在各種炎癥反應(yīng)，與目前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[18]，而通絡(luò)散結(jié)湯可降低2型糖尿病大鼠體內(nèi)相關(guān)炎癥因子水平，緩解炎癥反應(yīng)，改善2型糖尿病。