蘿卜硫素預(yù)處理通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB通路對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

李云鵬，楊玉丹

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

隨著冠脈介入技術(shù)及抗栓藥物的發(fā)展，缺血性心血管疾病的病死率得到了很大提高，但心肌梗死后心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷仍然難以避免，I/R損傷致心肌梗死后心室重構(gòu)，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，甚至死亡[1]。心肌I/R損傷是一系列炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡和自噬等機(jī)制參與的復(fù)雜的病理生理變化過(guò)程[2]。研究[3]表明，急性炎癥反應(yīng)在I/R早期階段起了關(guān)鍵作用，抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)可改善受損心功能，所以，控制炎癥是一種較好的改善心肌I/R損傷的治療策略，為臨床治療心肌I/R損傷提供了方向。蘿卜硫素是由硫甙衍生而來(lái)的一種異硫氰酸鹽，大量存在于蕓苔屬植物中，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤的作用[4]。作者前期研究[5]發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素能改善缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)所導(dǎo)致的心肌損傷，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立離體心肌H/R損傷模型模擬在體I/R損傷，觀察蘿卜硫素是否通過(guò)抑制炎癥來(lái)減輕心肌細(xì)胞H/R損傷及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料蘿卜硫素(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：S6317-5 mg)，乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒(美國(guó)Biovision公司)，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)。SD大鼠乳鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SYXK(豫)2019-0002]。

1.2原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和H/R模型制作參考既往文獻(xiàn)[5-6]分離SD大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞并制作H/R模型。H/R條件：將含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基更換為不含血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，用95%N2充入H/R培養(yǎng)箱內(nèi)先排空空氣，37 ℃培養(yǎng)3 h后將培養(yǎng)基更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)20%O2、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)3 h。

1.3不同濃度蘿卜硫素預(yù)處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞形態(tài)、存活率和LDH分泌的影響大鼠原代心肌細(xì)胞分為5組。正常對(duì)照組：原代心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)；H/R 組：給予缺氧3 h/復(fù)氧3 h處理；低、中、高濃度蘿卜硫素組：缺氧前1 h分別給予0.1、1.0、5.0 μmol/L蘿卜硫素預(yù)處理，然后建立H/R模型。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

細(xì)胞存活率檢測(cè)：將原代心肌細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種104個(gè)細(xì)胞。分組處理完成后，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTS(美國(guó)Promega公司)繼續(xù)培養(yǎng)4 h顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照孔吸光度。

LDH活性檢測(cè)：收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)LDH活性，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4蘿卜硫素對(duì)H/R心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和胞內(nèi)TLR4、MyD88和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響另取大鼠原代心肌細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種2×106個(gè)。分為3組，正常對(duì)照組、H/R組、蘿卜硫素組，前2組同上處理，蘿卜硫素組于缺氧前1 h給予5.0 μmol/L蘿卜硫素預(yù)處理，然后建立H/R模型。

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1β濃度，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

收集各組細(xì)胞提取總蛋白，上樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉后，加TLR4抗體(按1∶500稀釋)，MyD88、p-NF-κB p65和β-actin抗體 (均按1∶10 000稀釋)，4 ℃孵育，搖床過(guò)夜；加相應(yīng)二抗(按1∶8 000稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜。ECL發(fā)光，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)。以目的蛋白條帶和β-actin條帶灰度值的比值為目的蛋白的表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較5組心肌細(xì)胞存活率和LDH分泌水平，以及3組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度蘿卜硫素預(yù)處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞形態(tài)、存活率及LDH分泌的影響正常對(duì)照組心肌細(xì)胞存活狀態(tài)良好，搏動(dòng)有力并呈一致性；H/R組存活心肌細(xì)胞減少，細(xì)胞搏動(dòng)無(wú)力，節(jié)律改變；低、中、高濃度蘿卜硫素組存活細(xì)胞較H/R組增多，細(xì)胞搏動(dòng)轉(zhuǎn)好，高濃度(5.0 μmol/L)效果最好(圖1)。

與正常對(duì)照組對(duì)比，H/R組心肌細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞損傷和活性指標(biāo)LDH分泌水平升高(P<0.05)；與H/R組比較，中、高濃度蘿卜硫素均可升高心肌細(xì)胞存活率，降低LDH分泌水平，尤以高濃度(5 μmol/L)效果更好(P<0.05)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取5 μmol/L為蘿卜硫素的作用濃度。見(jiàn)表1。

A、B、C、D、E：分別為空白對(duì)照組，H/R組和低、中、高濃度蘿卜硫素組

表1 各組心肌細(xì)胞存活率及LDH分泌水平比較

2.2蘿卜硫素預(yù)處理對(duì)H/R心肌細(xì)胞炎癥因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平的影響見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，H/R組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β釋放增多；與H/R組比較，蘿卜硫素組炎癥因子的釋放減少(P<0.05)，表明蘿卜硫素對(duì)H/R造成的炎癥損傷具有改善作用。與正常對(duì)照組比較，H/R組心肌細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高；而蘿卜硫素預(yù)處理則可以減弱上述效應(yīng)(P<0.05)。

表2 各組心肌細(xì)胞炎癥因子分泌及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

在心肌I/R損傷初期，細(xì)胞損傷表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)，發(fā)生心功能障礙[7-8]；而促炎分子機(jī)制尚未完全闡明，所以研究I/R損傷過(guò)程中炎癥的預(yù)防治療十分有意義。研究[9]表明，右旋美托咪啶預(yù)處理通過(guò)抑制HMGB1蛋白的表達(dá)而減少細(xì)胞壞死性凋亡，改善心肌細(xì)胞H/R損傷。另有學(xué)者[10]研究發(fā)現(xiàn)，天然的黃酮刺槐素能夠減輕心肌細(xì)胞H/R損傷，其機(jī)制是通過(guò)AMPK介導(dǎo)的Nrf2激活，之后參與一系列抗炎、抗氧化、抗凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)而發(fā)揮作用。

研究[4]表明蘿卜硫素具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先設(shè)置不同濃度蘿卜硫素處理探索最佳的藥物濃度，結(jié)果顯示H/R后心肌細(xì)胞搏動(dòng)變差，存活率下降，LDH活性顯著增高，提示造模成功，而給予中、高濃度蘿卜硫素處理后，心肌細(xì)胞搏動(dòng)增強(qiáng)，存活率升高，LDH活性下降，表明蘿卜硫素可以改善H/R心肌細(xì)胞損傷，且5 μmol/L效果更好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，H/R組造模后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高，表明H/R后心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，應(yīng)用蘿卜硫素處理后上述炎癥因子下降，表明炎癥受到抑制。

TLR4影響多種生理、病理過(guò)程的基因調(diào)控，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著重要作用[11]。MyD88是TLR信號(hào)通路中的重要分子，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展；NF-κB p65是TLR4的下游效應(yīng)因子，TLR4可通過(guò)配體與MyD88結(jié)合，引起NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，然后NF-κB p65與DNA結(jié)合并參與IL-1β、IL-6和TNF-α多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[12]。故TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路在炎癥信號(hào)的傳遞中發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者[13]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆芽素A能夠通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥途徑減輕心肌H/R損傷。在本研究中，H/R能誘導(dǎo)TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)增強(qiáng)，蘿卜硫素處理后，三者表達(dá)均下降，表明蘿卜硫素可能是通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎癥從而減輕心肌H/R損傷，確切機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。