lncRNA PTPRG-AS1通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張 靖，馮曉杰，白惠娟

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)婦瘤科 鄭州 450008

卵巢癌是致命的婦科惡性腫瘤之一[1]。目前，卵巢癌治療主要采用手術(shù)聯(lián)合輔助化療等方法，但由于手術(shù)局限性、化療耐藥性以及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，晚期卵巢癌患者5 a生存率仍低于30%[2]。因此，了解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和分子改變對(duì)改善卵巢癌患者生存現(xiàn)狀具有重要意義。研究[3]表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。lncRNA的表達(dá)異常與卵巢癌的進(jìn)展有關(guān)。lncRNA生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，GAS5表達(dá)降低可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示卵巢癌預(yù)后不良[4]；lncRNA 性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族蛋白4(SOX4)在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)，SOX4表達(dá)水平升高與腫瘤體積、腫瘤分級(jí)、轉(zhuǎn)移距離呈正相關(guān)[5]；lncRNA HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，敲除HOTAIR基因可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬，從而提高卵巢癌對(duì)順鉑的敏感性[6]。有研究[7]通過(guò)基因芯片篩選卵巢癌中差異表達(dá)的lncRNA發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸磷酸酶受體G基因反義鏈1(PTPRG-AS1)在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。PTPRG-AS1是PTPRG的反義lncRNA，PTPRG可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路抑制鼻咽癌的生長(zhǎng)和侵襲[8]。本研究旨在探討PTPRG-AS1調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑人正常卵巢上皮細(xì)胞HOSE，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、OVCR3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；si-con、si-PTPRG-AS1以及PCR引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；PrimeScript one step RT-PCR試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、MTT試劑盒、PVDF膜、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI 1640和opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；兔源Cyclin D1、Bcl-2和Bax抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；鼠源Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗體為美國(guó)Santa Cruz產(chǎn)品；Trizol試劑、LipofectamineTM2000、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗為Invitrogen公司產(chǎn)品；胰島素生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2組織來(lái)源選擇2016年5月至2017年8月于我院確診并進(jìn)行手術(shù)切除的41例卵巢癌患者的癌組織和配對(duì)癌旁正常卵巢組織。將卵巢癌和正常卵巢組織標(biāo)本分成小塊，用不含RNA酶的磷酸鹽緩沖液洗滌后置于液氮中保存?；颊呔炗喼橥鈺g(shù)前均未接受過(guò)化療或放療。本研究經(jīng)我院倫理機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細(xì)胞，培養(yǎng)液中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 U/mL鏈霉素/青霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)期SKOV3接種于6孔板，待細(xì)胞約50%～60%匯合時(shí)，采用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h。取適量si-con或si-PTPRG-AS1加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫孵育5 min，同時(shí)加入LipofectamineTM2000。然后將含有si-con或si-PTPRG-AS1的混合物分別加入SKOV3細(xì)胞中，依次標(biāo)記為si-con組、si-PTPRG-AS1組，6 h后，更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染si-PTPRG-AS1 48 h后，用PI3K/AKT信號(hào)通路激活劑IGF-1處理細(xì)胞12 h，標(biāo)記為si-PTPRG-AS1+IGF-1組。

1.4qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PTPRG-AS1mRNA的表達(dá)分別提取HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細(xì)胞總RNA，利用Prime Script one step RT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，采用SYBR Green PCR試劑盒利用Bio-Rad系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：PTPRG-AS1上游為5’-GGGTAAGCGATC TACGCCC-3’，下游為5’-GTGGTTGCCCTCCTTAG GTC-3’；β-actin上游為5’-AAAGACCTGTACGC CAACAC-3’，下游為5’-GTCATACTCCTGCTTGCT GAT-3’。20 μL反應(yīng)體系: 10 μL 2×SYBR Green Taq 6 μL的H2O，上、下游引物 各1 μL、2 μL cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將各轉(zhuǎn)染組SKOV3細(xì)胞按照1×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，貼壁后加入20 μL MTT，再培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加150 μL的DMSO，繼續(xù)孵育2 h至結(jié)晶溶解，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)將SKOV3細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔接種于6孔板，按照1.3方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min。收集細(xì)胞，用1×結(jié)合緩沖液重懸，取100 μL細(xì)胞懸液(約含1×105個(gè)細(xì)胞)，隨后分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻避光孵育10 min，補(bǔ)足至500 μL，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測(cè)Cyclin D1、PTPRG、PI3K、Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白R(shí)IPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，4 ℃條件下與一抗(Cyclin D1、PTPRG、PI3K按照1∶1 000稀釋，Bax、Akt按照1∶1 500稀釋，Bcl-2按照1∶2 000稀釋，p-Akt按照1∶800稀釋，p-PI3K按照1∶500稀釋)孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，加二抗室溫孵育2 h。利用ECL發(fā)光顯色，Image J分析各條帶灰度值，β-actin為內(nèi)參。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0分析，2種卵巢組織中PTPRG-AS1 mRNA表達(dá)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，si-con和si-PTPRG-AS1組、si-PTPRG-AS1和si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；4種卵巢細(xì)胞間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.12種卵巢組織中PTPRG-AS1mRNA的表達(dá)卵巢癌組織中PTPRG-AS1表達(dá)量(3.21±0.22)較配對(duì)癌旁正常卵巢組織(1.00±0.09)增加(t=62.056，P<0.001)。

2.24種卵巢細(xì)胞中PTPRG-AS1mRNA的表達(dá)卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3、A2780、OVCR3)中PTPRG-AS1表達(dá)水平較正常卵巢上皮細(xì)胞HOSE升高(P<0.05)，見表1。

表1 4種卵巢細(xì)胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達(dá)

2.32組SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡比較si-PTPRG-AS1組SKOV3細(xì)胞PTPRG-AS1的表達(dá)水平較si-con組降低，提示抑制PTPRG-AS1表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細(xì)胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力降低，Bax蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率升高，見圖1和表2、3。

圖1 2組SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 2組SKOV3細(xì)胞PTPRG-AS1 mRNA、增殖和凋亡的比較(n=3)

表3 抑制PTPRG-AS1的表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

2.42組SKOV3細(xì)胞PTPRG及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細(xì)胞PTPRG蛋白表達(dá)升高，p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)降低，見圖2和表4，提示抑制PTPRG-AS1表達(dá)可上調(diào)SKOV3細(xì)胞PTPRG蛋白的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化。

2.5激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響與si-PTPRG-AS1組比較，si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細(xì)胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞A值升高，Bax蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率降低，見圖3和表5、6。以上結(jié)果表明，激活PI3K/Akt信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)抑制PTPRG-AS1表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖2 2組SKOV3細(xì)胞PTPRG及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4 2組SKOV3細(xì)胞PTPRG及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)( n=3)

圖3 激活PI3K/Akt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)PTPRG-AS1 siRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的影響(n=3)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球有20多萬(wàn)婦女被診斷出卵巢癌[9]。因此，了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的有效治療方法對(duì)卵巢癌患者的精準(zhǔn)治療意義重大。

lncRNA在轉(zhuǎn)錄和翻譯中起著重要的作用。PTPRG-AS1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型lncRNA，PTPRG-AS1在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與患者的預(yù)后和治療有關(guān)[10]；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，PTPRG-AS1通過(guò)靶向miR-185-5p調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]；在鼻咽癌中，PTPRG-AS1通過(guò)miR-194-3p分子海綿作用上調(diào)細(xì)胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(PRC1)表達(dá)進(jìn)而調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性和轉(zhuǎn)移[12]。然而，PTPRG-AS1在卵巢癌中的作用并未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，與正常卵巢上皮細(xì)胞比較，3株卵巢癌細(xì)胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達(dá)升高，與前人研究[7]相吻合。本研究結(jié)果亦表明抑制PTPRG-AS1表達(dá)后，SKOV3細(xì)胞增殖降低，細(xì)胞凋亡率增加促增殖蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，提示PTPRG-AS1可作為卵巢癌治療的新型分子靶點(diǎn)。

PI3K/Akt途徑是許多信號(hào)分子下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，其激活參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移和凋亡，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)，大量研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在卵巢癌中表現(xiàn)活躍，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖和凋亡異常。Jin等[13]發(fā)現(xiàn)，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)通過(guò)激活PI3K/AKT通路促進(jìn)上皮性卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移；王莉等[14]發(fā)現(xiàn)，利用siRNA干擾技術(shù)沉默高爾基體磷蛋白3(GOLPH3)可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路是遏制卵巢癌進(jìn)展的關(guān)鍵策略[15]。反義鏈RNA是研究最廣泛的一類lncRNA，其通過(guò)與正義鏈的mRNA相互作用調(diào)控基因沉默、轉(zhuǎn)錄及mRNA的穩(wěn)定性[16-17]。有研究[8]顯示，PTPRG通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路參與對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的調(diào)控。PTPRG-AS1是PTPRG的反義鏈lncRNA，卵巢癌細(xì)胞系中PI3K/Akt通路異常[15]。本研究采用RNA干擾技術(shù)抑制PTPRG-AS1在SKOV3細(xì)胞表達(dá)后，p-Akt的表達(dá)水平下降，而PTPRG蛋白的表達(dá)升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)抑制PTPRG-AS1表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。以上結(jié)果提示抑制PTPRG-AS1表達(dá)通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑活化進(jìn)而降低卵巢癌細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控PTPRG表達(dá)有關(guān)。但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，lncRNA PTPRG-AS1在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，抑制lncRNA PTPRG-AS1表達(dá)可通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑降低卵巢癌細(xì)胞增殖能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PTPRG-AS1有望成為一種新的卵巢癌治療分子靶點(diǎn)。