全反式維A酸對肺腺癌H1299細胞放射敏感性研究

孫 謙，宣愛麗，汪庚明，周詠春，徐洪波，何澤來，周 燕，周育夫，江 浩

2015年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，癌癥是91個國家70歲前人群的主要死亡原因。全球癌癥的發(fā)病率及死亡率呈迅速增長之態(tài)。目前全世界肺癌的發(fā)病率(11.6%)及死亡率(18.4%)均排第一位[1]，是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。目前對中晚期肺癌治療主要采取綜合治療，放療是肺癌綜合治療中重要的治療方法之一。在不同期別肺癌中均可應(yīng)用放療，但總體治療效果較差，治療失敗主要原因是局部未控及遠處轉(zhuǎn)移。非小細胞肺癌尤其是腺癌對放療不敏感，為提高放療敏感性，放射增敏劑是有效解決該難題的重要方法之一。

研究[2-3]發(fā)現(xiàn)全反式維A酸(all-trans retinoic acid，ATRA)作為維生素A的主要代謝產(chǎn)物，主要參與調(diào)控細胞的增殖分化，誘導腫瘤細胞凋亡，是一種誘導分化劑。研究[4]發(fā)現(xiàn)ATRA能夠增加胃癌細胞的凋亡及放射敏感性，可能與抑制細胞周期G2/M期的阻滯作用、下調(diào)Bcl-2與survivin mRNA表達、上調(diào)NF-κB與Bax mRNA表達有關(guān)。李明等[5]研究發(fā)現(xiàn)ATRA聯(lián)合放療具有協(xié)同誘導腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用，其分子機制可能與凋亡相關(guān)基因p38及MAPK蛋白表達上調(diào)、NF-κB蛋白表達下調(diào)有關(guān)。本研究探討ATRA對肺腺癌細胞株H1299放射敏感性的影響，為肺癌放射增敏提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌H1299細胞購買于ATCC細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone公司，ATRA、MTT試劑盒購自Sigma公司，細胞周期試劑盒及細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，survivin、NF-κB、GAPDH抗體購自Anbo公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肺腺癌H1299細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT法檢測ATRA及射線照射對肺腺癌H1299細胞存活率的影響 取對數(shù)生長期的H1299細胞，調(diào)整細胞密度為104/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，貼壁后，分別加入終濃度為0(對照組)、0.1、0.25、0.5、1.25、2.5、5、10 μmol/L的ATRA，每組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀測490 nm處檢測吸光度(A)，細胞生長抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。根據(jù)ATRA對H1299細胞增殖抑制的結(jié)果，選擇合適的刺激濃度，考察ATRA聯(lián)合射線照射和單獨ATRA相比，抑制H1299細胞增殖的效果。

1.2.3 平板克隆形成實驗 將處于對數(shù)生長期的H1299細胞，接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，每皿約150個細胞的濃度，實驗分2組：(1)放射組給予不同劑量X射線照射；(2)ATRA+放射組以10 μmol/L ATRA處理24 h后給予不同劑量X射線照射。使用6 mV的X線照射，照射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，將培養(yǎng)皿置于20 cm×20 cm照射野內(nèi)，源皮距為100 cm。照射后，更換無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆數(shù)及放射敏感性參數(shù)D0、Dq及N值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期 實驗分為4組：對照組、ATRA組(2 μmol/L)、2 Gy照射組及ATRA(2 μmol/L)+2 Gy照射組，將4組細胞處理后更換無藥培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后制備單細胞懸液，細胞凋亡及細胞周期分分布情況，分別經(jīng)AnnexinV-PE/7-AAD雙染和PI單染后上機檢測。

1.2.5 Western blotting檢測各組細胞survivin與NF-κB蛋白表達 實驗分3組：對照組、2 Gy照射組及ATRA(2 μmol/L)+2 Gy照射組，操作按文獻[5]進行，用quantity one軟件分析各組光密度值。蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/相應(yīng)內(nèi)參GAPDH光密度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測ATRA及射線照射對肺腺癌H1299細胞存活率的影響 不同濃度ATRA對肺腺癌H1299細胞均有抑制作用，濃度為10 μmol/L時最佳(P<0.01)，72 h時其抑制率達到最大值(見表1)。相對單獨ATRA處理，10 μmol/L ATRA聯(lián)合不同劑量的射線照射后，細胞生長抑制率明顯增加(P<0.01)(見表2)。

2.2 ATRA及ATRA聯(lián)合射線照射誘導H1299細胞凋亡 ATRA作用和射線照射后的細胞凋亡增多(P<0.01)，ATRA聯(lián)合射線照射作用后的細胞總凋亡率明顯高于單純射線照射(P<0.01)(見圖1、表3)。

2.3 ATRA及ATRA聯(lián)合射線照射對H1299細胞周期的影響 與對照組、放射組、ATRA組相比，ATRA+放射組細胞G0/G1期比例明顯增加(P<0.01)(見表4)。

2.4 ATRA對H1299細胞放射敏感性影響 與放射組相比，ATRA+放射組的細胞存活分數(shù)(SF2)值降低，ATRA可以增加肺腺癌H1299細胞放射敏感性，增敏比為1.406(見表5)。

2.5 各組H1299細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達情況 對照組、放射組、ATRA+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達水平呈下降的趨勢，且ATRP+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達水平明顯低于對照組和放射組(P<0.01)(見圖2、表6)。

表1 ATRA抑制H1299細胞生長

表2 射線單獨照射和10 μmol/L ATRA聯(lián)合射線照射對H1299細胞存活的影響

3 討論

放射治療在肺癌的根治性和姑息性治療中均起關(guān)鍵作用。在局部晚期[6]和早期[7]非小細胞肺癌中均得到證實。但肺癌總體預(yù)后較差，治療失敗主要原因局部未控及遠處轉(zhuǎn)移。在局部晚期非小細胞肺癌中經(jīng)放射治療后多數(shù)腫塊無法完全消失，為提高腫瘤局部控制率,近年來關(guān)于如何增加放射敏感性研究越來越多。

表3 ATRA及ATRA聯(lián)合射線照射誘導H1299細胞凋亡情況

研究[8-10]發(fā)現(xiàn)ATRA可以促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移，增加化療藥物敏感性[10]。王艷萍等[4]研究發(fā)現(xiàn)ATRA能夠增加胃癌細胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性，在肺腺癌H1299細胞中是否存在放射增敏作用，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究結(jié)果。本研究通過MTT法、平板克隆形成實驗、流式細胞術(shù)方法研究ATRA對肺腺癌H1299細胞存活率、放射敏感性、細胞周期的作用；同時應(yīng)用Western blotting檢測細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與放射組相比，ATRA+放射組細胞survivin與NF-κB蛋白表達被明顯抑制。平板克隆形成實驗也顯示，ATRA+放射組的D0、Dq、N及SF2均明顯低于放射組，表明放療敏感性增強。細胞周期實驗結(jié)果顯示，與對照組、放射組、ATRA組相比，ATRA+放射組G0/G1期比例明顯增加，與研究[11]結(jié)果相符。研究[12]發(fā)現(xiàn)survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SANDUR等[13]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細胞中放療增加NF-κB表達，出現(xiàn)放療抵抗，加入姜黃素后NF-κB表達明顯下降，放射敏感性明顯增加。李曉波等[14]在肺癌細胞中也得到相同結(jié)果。李明等[5]應(yīng)用替莫唑胺、ATRA聯(lián)合放療抗腦膠質(zhì)瘤U251細胞研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組細胞凋亡數(shù)明顯增高，聯(lián)合組與對照組、放療組及藥物組比較p38MAPK表達明顯上調(diào)，聯(lián)合組與對照組、放射組及藥物組比較，NF-κB表達明顯下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與對照組及放射組相比，ATRA+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達量均明顯降低，提示ATRA可能通過下調(diào)survivin與NF-κB表達增加H1299細胞放射敏感性。

表4 ATRA及ATRA聯(lián)合射線照射對H1299細胞周期的影響

表5 ATRA對H1299細胞放射敏感性影響

表6 各組H1299細胞survivin與NF-κB的蛋白表達情況

綜上所述，ATRA對肺腺癌H1299細胞具有放射增敏作用，其機制可能與ATRA直接抑制H1299細胞增殖、促進H1299細胞凋亡，下調(diào)survivin及NF-κB蛋白表達有關(guān)。