10種常用殺菌劑對(duì)水稻紋枯病菌的敏感性及其協(xié)同作用

周艾艾　田旭軍　劉世江　丁怡　趙琪君　李明　李榮玉

摘要：【目的】篩選出對(duì)水稻紋枯病菌具有較好協(xié)同作用的藥劑組合，為田間防治水稻紋枯病和開(kāi)發(fā)增效組合制劑提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳运炯y枯病菌為材料，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定10種常用殺菌劑原藥（包括嘧菌酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯等8種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑2種三唑類殺菌劑）對(duì)水稻紋枯病菌的毒力，及丙環(huán)唑·肟菌酯組合對(duì)水稻紋枯病菌的協(xié)同作用;采用電導(dǎo)率法、可溶性蛋白試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和過(guò)氧化物酶（POD）試劑盒等評(píng)價(jià)殺菌劑組合對(duì)水稻紋枯病菌生理生化特性的影響。2019年8月進(jìn)行田間試驗(yàn)，評(píng)價(jià)250 g/L丙環(huán)唑EC、50%肟菌酯WDG及組合（250 g/L丙環(huán)唑EC與50%肟菌酯WDG有效質(zhì)量比1∶5）對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果?！窘Y(jié)果】10種殺菌劑原藥對(duì)水稻紋枯病菌均有較高的毒力，EC50為0.20～1.61 μg/mL，除唑菌酯和醚菌酯對(duì)紋枯病菌的毒力相對(duì)較弱外，其余8種殺菌劑對(duì)紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)均具有較好的抑制作用，EC50均小于1.00 μg/mL，以吡唑醚菌酯的毒力作用最強(qiáng)，EC50為0.20 μg/mL。丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按有效質(zhì)量比1∶10、1∶5和5∶1組合時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌均具有較好的協(xié)同作用，其中以1∶5組合時(shí)協(xié)同作用較明顯，EC50為0.24 μg/mL，共毒系數(shù)（CTC）為393.41;用該組合處理水稻紋枯病菌后，能提高病菌細(xì)胞膜的通透性，明顯抑制蛋白的合成，降低SOD和POD活性。田間噴施250 g/L丙環(huán)唑EC與50%肟菌酯WDG組合后21 d，對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果達(dá)94.08%，高于單劑250 g/L丙環(huán)唑EC（88.79%）和50%肟菌酯WDG（92.72%）處理?！窘Y(jié)論】丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌具有較好的協(xié)同作用，對(duì)水稻紋枯病具有較好的防治效果，且可極大減少藥劑使用量，具有開(kāi)發(fā)成水稻紋枯病增效組合制劑的潛力。

關(guān)鍵詞： 殺菌劑;水稻紋枯病菌;敏感性;協(xié)同增效

中圖分類號(hào)： S482.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）01-0086-09

Abstract：【Objective】Screening the fungicide combinations that had a strong synergistic action on Rhizoctonia Solani and providing a new theoretical basis for filed control of synergistic action and developing synergism combinations against R. solani. 【Method】R. solani was the material. The mycelial growth rate method was used to determine the virulence of ten fungisides（eight methoxyacrylate fungicides such as azoxystrobin， picoxystrobin and pyraclostrobin， and two kinds of triazole fungicides including propiconazole and difenoconazole） to R. solani. The synergistic effect of propiconazole·trifloxystrobin combination to R. solani was determined by mycelium growth rate method. The effects of the combination on the physiology and biochemistry of R. solani were evaluated by conductivity method， soluble protein kit， superoxide dismutase（SOD） kit and peroxidase（POD） kit. And the field experiment was conducted in August， 2019 to evaluate the field control effects of 250 g/L propiconazole EC， 50% trifloxystrobin WDG and combinations（effective mass ratio of 250 g/L propiconazole EC to 50% trifloxystrobin WDG was 1∶5） on? rice sheath blight disease. 【Result】The results showed that the ten fungicides had high sensitivity to R. solani. The EC50 range was 0.20-1.61 μg/mL. Among them， the virulence of pyraoxystrobin and kresoxim-methyl was relatively weak. And the other eight fungicides had better inhibitory activity on the mycelial growth of R. solani， their EC50 were all less than 1.00 μg/mL. The virulence of pyraclostrobin was the strongest with EC50 of 0.20 μg/mL. Propiconazole and trifloxystrobin had better synergistic effects on R. solani when the effective mass ratios were 1∶5， 1∶10 and 5∶1. Among them， the synergism was the most obvious when the effective mass ratio was 1∶5. Its EC50 value was 0.24 μg/mL and cotoxicity coefficient（CTC） value was 393.41. Furthermore， the combination could increase the permeability of cell membrane， inhibit the synthesis of protein and decrease the activity of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase（POD） after the treatment. After 21 d of field spraying the synergistic combination of 250 g/L propiconazole EC and 50% trifloxystrobin WDG， the control effect of rice sheath blight was 94.08%， which was higher than that of single application of propiconazole EC（88.79%） and 50% trifloxystrobin? WDG（92.72%）. 【Conclusion】The results show that the combination of propiconazole·trifloxystrobin has a better synergistic effect on R. solani. It has good control effect on rice sheath blight， and can greatly reduce the dosage of fungiside， and has the potential to be developed into a combination preparation for rice sheath blight.

Key words： fungicides; Rhizoctonia solani; sensibility; synergies

Fundation item： National Key Research and Development Program of China（2016YFD0200500）; National Natural Science Foundation of China（31701816）; Science and Technology Project of Guizhou（QKHJC〔2017〕1038， QKHPTRC〔2017〕5788）

0 引言

【研究意義】水稻作為我國(guó)主要的糧食作物，其種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，在單產(chǎn)不斷提高的同時(shí)，病蟲(chóng)害頻發(fā)嚴(yán)重危害其產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收（李燁鋒等，2020）。由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起的紋枯病是危害水稻的主要真菌病害之一，其發(fā)生條件要求不高，水稻較易患病，難以防控，在全球范圍內(nèi)均有發(fā)生（章帥文等，2019;朱鳳等，2020;Kora et al.，2020）。當(dāng)前生產(chǎn)中對(duì)水稻紋枯病的防治仍以化學(xué)防治為主（孟琳，2013;Peng et al.，2014;羊紹武等，2019），但農(nóng)藥的不合理、長(zhǎng)期、單一使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。將殺菌劑合理配伍聯(lián)用不僅能延長(zhǎng)病原菌產(chǎn)生抗藥性的時(shí)間，還能提高單一藥劑的防治效果，節(jié)省成本（Nottensteiner et al.，2019），對(duì)安全高效防控水稻紋枯病和延長(zhǎng)殺菌劑的使用時(shí)間具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】除化學(xué)防治外，水稻紋枯病的防治方法還有生物防治和抗性育種等（俞寅達(dá)等，2019;楊秀榮等，2020），但生物防治的基礎(chǔ)設(shè)施相對(duì)落后，農(nóng)民因?qū)ζ湔J(rèn)識(shí)不足而難以大面積推廣，且長(zhǎng)期單一使用抗病品種易使品種抗性喪失（李明友等，2019）。在我國(guó)一些水稻產(chǎn)區(qū)紋枯病菌對(duì)部分農(nóng)藥已產(chǎn)生不同程度的抗性，張秀煥（2015）通過(guò)抗性菌株適合度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)水稻紋枯病菌對(duì)氟醚菌酰胺存在中等或較高抗性風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，學(xué)者們?cè)谒巹┙M合防治病害研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展。漆艷香等（2020）將5%氨基寡糖素水劑與25%丙環(huán)唑乳油進(jìn)行混配，研究其對(duì)香蕉褐緣灰斑病的防效，結(jié)果表明，氨基寡糖素與丙環(huán)唑混配可減少丙環(huán)唑的用量，提高對(duì)香蕉褐緣灰斑病的防治效果;王國(guó)禎等（2020）研制了16%烯丙苯噻唑·氟唑環(huán)菌胺復(fù)配顆粒劑配方并檢測(cè)其理化性質(zhì)，同時(shí)檢驗(yàn)顆粒劑對(duì)水稻稻瘟病和紋枯病的防治效果，結(jié)果表明，將2種藥劑復(fù)配使用可提高對(duì)2種病害防治的速效性及秧苗的抗病性，實(shí)現(xiàn)2種藥劑優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，所制備的顆粒劑劑型具有緩釋性和隱蔽用藥的特點(diǎn)，可保證田間施藥環(huán)節(jié)的環(huán)境安全性。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑屬線粒體呼吸抑制劑，通過(guò)鎖住細(xì)胞色素b與細(xì)胞色素c1間的電子傳遞影響細(xì)胞三磷酸腺苷（ATP）酶的合成，從而實(shí)現(xiàn)最小毒性和高度安全性的抗菌效果，但其作用位點(diǎn)單一，極易產(chǎn)生抗藥性（Debona et al.，2018;毛連綱等，2019）。三唑類殺菌劑通過(guò)抑制麥角甾醇生物合成，破壞病原菌的細(xì)胞膜功能，引起細(xì)胞死亡，從而殺滅病原菌，達(dá)到防治病害的目的，可防治多種病害（張寧等，2016;李美霖等，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于三唑類殺菌劑丙環(huán)唑與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑肟菌酯組合的研究尚無(wú)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定10種常用殺菌劑原藥對(duì)水稻紋枯病菌的毒力及丙環(huán)唑·肟菌酯不同組合對(duì)水稻紋枯病菌的協(xié)同作用，以期篩選出對(duì)水稻紋枯病菌具有較好協(xié)同作用的藥劑組合，為田間防治水稻紋枯病和開(kāi)發(fā)增效組合制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試病原菌 水稻紋枯病菌由貴州大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 1. 2 供試藥劑及試劑盒 供試甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑共8種：98%嘧菌酯原藥、96%醚菌酯原藥、98%吡唑醚菌酯原藥和95%啶氧菌酯原藥均由山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司提供，95%唑菌酯原藥購(gòu)自沈陽(yáng)科創(chuàng)化學(xué)品有限公司，96%丁香菌酯原藥購(gòu)自吉林省八達(dá)農(nóng)藥有限公司，95%唑胺菌酯原藥購(gòu)自沈陽(yáng)化工研究院，98%肟菌酯原藥購(gòu)自山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司;三唑類殺菌劑2種：97%苯醚甲環(huán)唑原藥購(gòu)自山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司，98%丙環(huán)唑原藥購(gòu)自上虞穎泰精細(xì)化工有限公司;商品制劑2種：50%肟菌酯WDG購(gòu)自河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，250 g/L丙環(huán)唑EC購(gòu)自山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司。試劑盒：可溶性蛋白試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和過(guò)氧化物酶（POD）試劑盒均由北京索萊寶有限公司提供。

1. 1. 3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、去離子水1 L。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 10種殺菌劑原藥對(duì)水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 參考王彥等（2016）采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定，略有修改。在潔凈操作臺(tái)上用丙酮溶液將稱取的殺菌劑原藥定量稀釋成1000 μg/mL母液，進(jìn)一步用含0.5% Tween-20的蒸餾水將母液稀釋成預(yù)設(shè)的5個(gè)梯度濃度。PDA培養(yǎng)基用微波爐加熱融化，冷卻至60～70 ℃，按9∶1的比例將PDA培養(yǎng)基和配好的藥劑混勻倒入培養(yǎng)皿中，制成目標(biāo)濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，對(duì)照則按9∶1的比例將PDA培養(yǎng)基與含0.5% Tween-20的蒸餾水混勻。紫外燈照射殺菌30 min后，用直徑5 mm的打孔器沿活化好的菌落邊緣打出均勻菌餅，用接種針將菌餅接到冷卻凝固的培養(yǎng)基中心，有菌絲面朝下，每處理重復(fù)3次作為預(yù)試驗(yàn)，倒置放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，待空白對(duì)照的菌絲生長(zhǎng)滿培養(yǎng)基2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（cm），重復(fù)4次取其平均值，按公式（1）計(jì)算各處理的抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑×100? （1）

在各處理濃度對(duì)數(shù)（X）與抑制率值（Y）間進(jìn)行回歸分析，用DPS 18.10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算有效抑制中濃度（EC50）和毒力回歸方程（劉全國(guó)，2013）。

1. 2. 2 丙環(huán)唑·肟菌酯及其不同組合對(duì)水稻紋枯病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，從活化好的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，分別接入含有不同濃度丙環(huán)唑原藥和肟菌酯原藥及其組合藥劑的PDA培養(yǎng)基上，毒力測(cè)定方法同1.2.1。丙環(huán)唑和肟菌酯單劑及其組合的濃度梯度設(shè)置：丙環(huán)唑原藥：0.02、0.08、0.32、1.28和5.12 μg/mL;肟菌酯原藥：0.05、0.20、0.80、3.20和12.80 μg/mL;丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥分別按有效質(zhì)量比1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1組合，濃度梯度設(shè)為0.04、0.16、0.64、2.56和10.24 μg/mL。對(duì)照同1.2.1，每處理4次重復(fù)。

根據(jù)孫云沛法（Sun and Johnson，1960）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將測(cè)定的各處理EC50換算成實(shí)際毒性指數(shù)（ATI）;根據(jù)組合的配比，計(jì)算理論毒性指數(shù)（TTI）。按公式（2）（3）（4）（5）計(jì)算混劑的共毒系數(shù)（CTC）。

毒力指數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)藥劑EC50/供試藥劑EC50 （2）

實(shí)測(cè)（混用）毒力指數(shù)（ATI）=標(biāo)準(zhǔn)藥劑EC50/供

試藥劑（混用）

EC50×100? （3）

理論混用毒力指數(shù)（TTI）=A的毒力指數(shù)×A在混

用中的含量（%）+B的

毒力指數(shù)×B在混用

中的含量（%） （4）

共毒系數(shù)（CTC）=ATT/TTI×100 （5）

1. 2. 3 水稻紋枯病菌菌絲懸浮液培養(yǎng) 參考司洪陽(yáng)等（2017）的方法，將紋枯病菌菌餅接到事先準(zhǔn)備好的PD培養(yǎng)基中，150 r/min下25 ℃培養(yǎng)48 h，形成均勻的菌絲懸浮液。

1. 2. 4 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌細(xì)胞通透性測(cè)定 參考劉佳怡等（2019）的方法，于菌絲懸浮液中按9∶1的比例加入丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同組合（丙環(huán)唑與肟菌酯有效質(zhì)量比分別為1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1，下同）的EC50濃度處理培養(yǎng)，無(wú)菌水作對(duì)照，充分混勻，用DDS-307型電導(dǎo)率儀測(cè)定各樣品電導(dǎo)率的本底值J0;分別于處理0、1、2、4、8、12、24、48和72 h后取出10 mL離心（4000 r/min，5 min），用上清液測(cè)定其電導(dǎo)率J1;最后煮沸死處理15 min，冷卻，離心，用上清液測(cè)定電導(dǎo)率J2。各處理重復(fù)3次，取其平均值按公式（6）計(jì)算各時(shí)間段的相對(duì)滲透率。

某時(shí)段相對(duì)滲透率（%）=（J1-J0）/（J2-J0）×100 （6）

1. 2. 5 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白提?。涸诰z懸浮液中加入丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同組合的EC50濃度處理培養(yǎng)，分別于處理1、3、6、9、12、24、48和72 h后取10 mL離心（6000 r/min，5 min），棄上清液，將沉淀轉(zhuǎn)入研缽，加入Tris-HCl緩沖液（0.05 mol，pH 7.5），用液氮破碎后，轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行鏡檢，無(wú)完整細(xì)胞后，再離心（4 ℃，10000 r/min，15 min），小心取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，用于測(cè)定可溶性蛋白含量。

可溶性蛋白含量測(cè)定：采用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。依次加入0.1 mL上清液，6.0 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液（考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液∶蒸餾水=1∶4），以加入0.1 mL蒸餾水為空白對(duì)照，以加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白（0.563 g/L）為標(biāo)準(zhǔn)，靜置5 min后，于595 nm處測(cè)定其吸光值，各處理3次重復(fù)（劉琳等，2019）。

1. 2. 6 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌SOD活性的影響 SOD提?。涸诰z懸浮液中加入丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同組合的EC50濃度處理培養(yǎng)，分別于處理0、3、6、9、12、24和48 h后取10 mL離心（6000 r/min，5 min），棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液（0.1 mol，pH 7.2）沖洗，棄上清液，向離心管中按1∶10的體積比加入SOD提取液，冰浴勻漿后離心（4 ℃，8000 r/min，10 min），取上清液置冰上，用于SOD活性測(cè)定。

SOD活性測(cè)定：采用北京索萊寶公司提供的SOD檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前先將分光光度計(jì)預(yù)熱至少30 min，波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至560 nm，用蒸餾水調(diào)零;測(cè)定前將試劑1、2和4于25 ℃水浴5 min以上。在同質(zhì)地標(biāo)準(zhǔn)試管中依次加入240 μL試劑1、510 μL試劑2、6 μL試劑3、90 μL樣本（對(duì)照管加等體積蒸餾水）及180 μL試劑4，充分混勻后，室溫靜止30 min，快速轉(zhuǎn)移至1 mL玻璃比色皿中，560 nm處測(cè)定各管吸光值A(chǔ)，每處理3次重復(fù)。

1. 2. 7 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌POD活性的影響 POD提?。涸诰z懸浮液中加入丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同組合的EC50濃度處理培養(yǎng)，分別于處理0、3、6、9、12、24和48 h后取10 mL離心（6000 r/min，10 min），棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液（0.1 mol，pH 7.2）沖洗2次，棄上清液，向離心管中按1∶10的體積比加入POD提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，液氮充分破碎，轉(zhuǎn)入離心管中，鏡檢，無(wú)完整細(xì)胞后，在4 ℃下10000 r/min離心15 min，吸取上清液于1.5 mL離心管中，用于POD活性測(cè)定。

POD活性測(cè)定：采用北京索萊寶公司提供的POD檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定前先將分光光度計(jì)預(yù)熱至少30 min，把波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至470 nm，用蒸餾水調(diào)零;測(cè)定前將試劑1、2和3于37 ℃水浴10 min;在1 mL玻璃比色皿中依次加入15 μL樣本、270 μL蒸餾水、520 μL試劑1、130 μL試劑2及135 μL試劑3，立即混勻并記錄時(shí)間，測(cè)定470 nm下30 s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和1 min 30 s后的吸光值A(chǔ)2，各處理3次重復(fù)。

1. 2. 8 丙環(huán)唑和肟菌酯商品藥劑及組合對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果試驗(yàn) 試驗(yàn)于2019年8月在貴州省惠水縣好花紅鎮(zhèn)進(jìn)行，供試水稻品種為茂優(yōu)601，水稻長(zhǎng)勢(shì)均勻。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：250 g/L丙環(huán)唑EC（有效成分用量112.5 g/ha）、50%肟菌酯WDG（有效成分用量120.0 g/ha）、丙環(huán)唑·肟菌酯（1∶5）（有效成分用量22.5 g/ha+75.0 g/ha）、清水（CK），共4個(gè)處理，小區(qū)面積30 m2，每處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。于水稻抽穗期第1次調(diào)查紋枯病的發(fā)生情況，調(diào)查方法根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17980.19—2000《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一） 殺菌劑防治水稻紋枯病》的相關(guān)規(guī)定。以株為單位，根據(jù)水稻葉片和葉鞘的為害癥狀程度進(jìn)行分級(jí)，各小區(qū)五點(diǎn)取樣法取樣，每點(diǎn)調(diào)查5叢，記錄總株數(shù)、病株數(shù)和病級(jí)數(shù)（程應(yīng)德等，2019）。第1次調(diào)查后施藥，采用3WBJ-16DZ多功能靜電噴霧器噴藥，全株均勻噴霧，分別于藥后7、14 和21 d進(jìn)行第2次調(diào)查，調(diào)查方法同上。按照公式（7）和（8）計(jì)算病情指數(shù)和田間防治效果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法（DMRT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（劉祥臣等，2017）。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查

總?cè)~數(shù)×9）×100? ? ? ? ? ? ? ?（7）

防治效果（%）=[1-（對(duì)照區(qū)藥前病性指數(shù)×處理

區(qū)藥后病情指數(shù)）/（對(duì)照區(qū)藥后

病性指數(shù)×處理區(qū)藥膠病情指

數(shù)）]×100 （8）

2 結(jié)果與分析

2. 1 水稻紋枯病菌對(duì)10種殺菌劑原藥的敏感性測(cè)定結(jié)果

由表1可知，10種殺菌劑原藥對(duì)水稻紋枯病菌均具有一定的抑制效果。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑中的嘧菌酯、肟菌酯、丁香菌酯、啶氧菌酯、吡唑醚菌酯和唑胺菌酯對(duì)水稻紋枯病菌的毒力作用較強(qiáng)，EC50均小于1.00 μg/mL，其中以吡唑醚菌酯的毒力作用最強(qiáng)，EC50為0.20 μg/mL，該類殺菌劑中毒力作用相對(duì)較弱的是醚菌酯，EC50為1.61 μg/mL;三唑類殺菌劑中丙環(huán)唑?qū)λ炯y枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑，EC50為0.34 μg/mL。

2. 2 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌的協(xié)同作用

由表2可知，丙環(huán)唑和肟菌酯原藥對(duì)水稻紋枯病菌均具有較高活性，其EC50分別為0.29和1.67 μg/mL。丙環(huán)唑和肟菌酯原藥按有效質(zhì)量比1∶10、1∶5和5∶1組合時(shí)均具有協(xié)同作用，CTC為127.33～393.41，其中有效質(zhì)量比為1∶5時(shí)的協(xié)同作用最佳，其CTC為393.41，EC50為0.24 μg/mL;丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥有效質(zhì)量比為10∶1時(shí)的CTC為111.67，呈相加作用;丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥有效質(zhì)量比為1∶1時(shí)的CTC為65.89，呈拮抗作用。

2. 3 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌細(xì)胞通透性的影響

以丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同比例組合的EC50處理水稻紋枯病菌菌絲懸浮液，采用外滲電導(dǎo)法測(cè)定電導(dǎo)率，結(jié)果（圖1）顯示，處理初期，各處理的相對(duì)滲透率較低且差異不明顯，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各藥劑處理菌絲懸浮液的相對(duì)滲透率上升較大，而空白對(duì)照上升相對(duì)較小;12 h后各藥劑處理的相對(duì)滲透率逐漸趨于平緩，但總體上均比對(duì)照高;至24 h時(shí)丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1組合處理菌絲后的相對(duì)滲透率分別較對(duì)照處理提高35.78%、6.84%、20.76%、11.47%和15.16%。因此，進(jìn)一步確認(rèn)丙環(huán)唑·肟菌酯處理能提高紋枯病菌的細(xì)胞膜通透性，對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生一定的損傷作用。

2. 4 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌可溶性蛋白含量的影響

由圖2可看出，水稻紋枯病菌菌絲體經(jīng)丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同比例組合處理后，菌絲體可溶性蛋白含量呈不規(guī)則有升有降反復(fù)變化趨勢(shì)，與對(duì)照處理有明顯差異，其中處理后9～24 h差異尤為明顯，丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1組合處理9 h后，水稻紋枯病菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量分別較對(duì)照下降54.46%、80.92%、67.53%、59.82%和55.95%。表明丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌蛋白質(zhì)的合成具有明顯抑制作用。

2. 5 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌SOD活性的影響

由圖3可看出，水稻紋枯病菌菌絲體經(jīng)丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同比例組合處理后，其菌絲SOD活性整體上呈先降后升的變化趨勢(shì)，且均明顯低于對(duì)照處理，尤其在處理9 h時(shí)差異較明顯，丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1組合處理后菌絲SOD活性分別較對(duì)照降低31.08%、40.44%、34.00%、39.93%和30.35%。說(shuō)明水稻紋枯病菌菌絲體經(jīng)丙環(huán)唑·肟菌酯處理后，其菌絲SOD活性發(fā)生明顯變化，比對(duì)照處理的SOD活性低，丙環(huán)唑·肟菌酯能降低菌體SOD活性，破壞細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝組分，從而表現(xiàn)出對(duì)病原菌的抑制作用。

2. 6 丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌POD活性的影響

由圖4可知，水稻紋枯病菌菌絲體經(jīng)丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥不同比例組合處理后，丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶10和1∶5組合處理的菌絲POD活性先降后升，24 h后又呈下降趨勢(shì);而丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶1、5∶1和10∶1組合處理的菌絲POD活性先上升后下降隨后趨于平緩，但菌絲POD活性整體上較對(duì)照處理低，至24 h時(shí)的差異尤為明顯，丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按1∶10、1∶5、1∶1、5∶1和10∶1組合處理菌絲POD活性分別較對(duì)照降低55.30%、8.26%、29.72%、79.16%和66.45%。由此可見(jiàn)，丙環(huán)唑·肟菌酯可使水稻紋枯病菌菌絲POD活性降低，以至于過(guò)氧化氫（H2O2）過(guò)量積累，干擾新陳代謝，表現(xiàn)出丙環(huán)唑·肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用。

2. 7 丙環(huán)唑·肟菌酯及其最佳組合對(duì)水稻紋枯病的田間防治效果

由表3可知，藥后7 d，250 g/L丙環(huán)唑EC、50%肟菌酯WDG及其最佳組合（1∶5）對(duì)水稻紋枯病的防效分別為42.58%、42.22%和58.94%，兩者組合的田間防治效果較單劑好，但相互間無(wú)顯著差異（P<0.05，下同）;藥后14 d，丙環(huán)唑、肟菌酯及其組合的田間防治效果分別為78.32%、80.94%和84.07%，防治效果較藥后7 d有明顯提升，且丙環(huán)唑·肟菌酯組合的田間防治效果也高于單劑，但相互間無(wú)顯著差異;藥后21 d，丙環(huán)唑、肟菌酯及其組合的田間防治效果分別為88.79%、92.72%和94.08%，防治效果較藥后7和14 d有明顯提升，且丙環(huán)唑·肟菌酯組合的田間防治效果也高于單劑，但相互間無(wú)顯著差異。

3 討論

本研究通過(guò)測(cè)定嘧菌酯等10種殺菌劑原藥對(duì)水稻紋枯病菌的毒力，EC50為0.20～1.61 μg/mL，均具有較強(qiáng)的毒力作用，10種殺菌劑均可用于水稻紋枯病的防治，其中丙環(huán)唑和肟菌酯對(duì)水稻紋枯病菌的EC50分別為0.34和0.35 μg/mL，與劉世江等（2020）的研究結(jié)果（0.022～1.561 μg/mL）相符，但與連娜娜（2019）的研究結(jié)果（0.0690 μg/mL）存在差異，可能是由于地理位置不同導(dǎo)致病原菌菌株間存在差異。本研究的丙環(huán)唑·肟菌酯不同組合毒力測(cè)定結(jié)果顯示，丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥按有效質(zhì)量比1∶5組合時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌具有較好的協(xié)同作用，其EC50為0.24 μg/mL，CTC為393.41;田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，丙環(huán)唑·肟菌酯有效質(zhì)量比為1∶5的增效組合藥后7～21 d對(duì)水稻紋枯病的防治效果均高于同一處理時(shí)間的單劑防治效果。周方等（2018）研究表明，20%嘧菌酯與12.5%苯醚甲環(huán)唑混配劑對(duì)稻瘟病和紋枯病均有顯著的防治效果，相對(duì)于2種單劑，防治效果增加10%左右;劉亮等（2019）研究表明，申嗪霉素與咪唑菌酮的配比在50∶1～1∶50時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌具有良好的增效作用。本研究對(duì)水稻紋枯病菌生理生化測(cè)定結(jié)果顯示，丙環(huán)唑·肟菌酯組合處理可提高紋枯病菌的細(xì)胞膜通透性，對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生一定的損傷作用，與張俊（2019）的研究結(jié)果相符，即高濃度的丙環(huán)唑可增大指狀青霉菌菌絲細(xì)胞膜的通透性;對(duì)紋枯病菌可溶性蛋白的合成具有明顯抑制作用，與朱潔（2013）研究發(fā)現(xiàn)肟菌酯可通過(guò)降低菌絲蛋白合成而實(shí)現(xiàn)對(duì)病原真菌的抑制作用一致;能降低紋枯病菌菌絲SOD活性，促進(jìn)菌體細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)H2O2的積累，對(duì)細(xì)胞造成傷害，干擾細(xì)胞內(nèi)新陳代謝，從而表現(xiàn)出對(duì)病原菌的抑制作用;同時(shí)使紋枯病菌菌絲POD活性降低，導(dǎo)致有害物質(zhì)H2O2的過(guò)量積累，使酶蛋白分子等細(xì)胞內(nèi)組分受到破壞，干擾新陳代謝，從而使殺菌劑充分發(fā)揮其殺菌機(jī)制，對(duì)病原菌具有高效的殺滅作用。

目前，尚未見(jiàn)將丙環(huán)唑與肟菌酯組合應(yīng)用于水稻病害防治的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定丙環(huán)唑與肟菌酯不同比例組合對(duì)水稻紋枯病菌的毒力，初步篩選出具有協(xié)同作用的組合，組合藥劑提高了水稻紋枯病菌菌絲細(xì)胞膜的通透性、抑制可溶性蛋白合成、降低SOD和POD活性，并評(píng)價(jià)商品制劑的田間防治效果，結(jié)果表明藥劑組合后不僅提高了對(duì)水稻紋枯病的防治效果，極大減少了藥劑使用量，還具有較長(zhǎng)的持效期。但水稻紋枯病菌經(jīng)丙環(huán)唑與肟菌酯組合處理后需從多角度對(duì)病菌組織內(nèi)其他酶類如多酚氧化酶和幾丁質(zhì)酶等進(jìn)行相關(guān)研究，組合制劑的實(shí)際應(yīng)用效果也需在多個(gè)試驗(yàn)地進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

將不同作用機(jī)理的殺菌劑丙環(huán)唑原藥與肟菌酯原藥組合后對(duì)水稻紋枯病菌具有較好的協(xié)同作用，丙環(huán)唑·肟菌酯按有效質(zhì)量比1∶5組合對(duì)水稻紋枯病菌的協(xié)同作用最佳，將其商品藥劑組合應(yīng)用于田間防治水稻紋枯病的防治效果高于單劑，且極大減少藥劑使用量，具有開(kāi)發(fā)成防治水稻紋枯病增效組合制劑的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）