基于檸檬酸合成的新型可降解螺釘生物相容性和生物力學(xué)特性的研究

楊誠(chéng)，李禎，廖堅(jiān)文，樊仕才，楊健，白曉春

1.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東省骨科研究院，廣州 510630；2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071；3.美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)材料與生物技術(shù)研究室，賓夕法尼亞州 16802；4.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物教研室，廣州510515

目前臨床應(yīng)用的金屬材料（不銹鋼、鈷合金、鈦合金等）具有需二次手術(shù)取出金屬內(nèi)固定材料、應(yīng)力遮擋作用及在體內(nèi)釋放金屬離子等缺點(diǎn)[1～5]，而以聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic，PGA）為代表的可降解吸收的高分子生物材料也存在自身的缺點(diǎn)：降解速度與新生骨生成速率不一致，降解產(chǎn)物多數(shù)呈酸性，長(zhǎng)期在體內(nèi)蓄積會(huì)導(dǎo)致局部PH值降低，進(jìn)而造成遲發(fā)性無(wú)菌性炎癥、釘?shù)乐車(chē)侨芙獾炔l(fā)癥[6～8]。研究表明，作為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物之一的檸檬酸（citric acid），在骨組織固有成分中占5%，且人體90%以上檸檬酸分子存在于骨中；天然骨磷灰石納米晶體表面的檸檬酸酯與磷灰石、膠原蛋白緊密結(jié)合，這些含檸檬酸的有機(jī)基質(zhì)在調(diào)節(jié)磷灰石納米晶體的厚度，控制骨的強(qiáng)度及骨應(yīng)力傳導(dǎo)中起重要作用[9～13]。受此啟發(fā)，本實(shí)驗(yàn)室與美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)材料與生物技術(shù)研究室的楊健教授團(tuán)隊(duì)協(xié)作，合成一系列基于檸檬酸的可降解骨生物仿生材料，并在動(dòng)物與細(xì)胞模型中驗(yàn)證了這些材料具有良好的骨融合與骨誘導(dǎo)性能[14～18]。本實(shí)驗(yàn)利用前期合成的檸檬酸多聚體與納米羥基磷灰石復(fù)合高分子材料Poly（octanediol citrate）-click-Hydroxyl apatite（以下簡(jiǎn)稱(chēng)POC-Click-HA）制作全螺紋松質(zhì)骨螺釘，用于比格犬股骨外髁骨折（AO 分型33B1 型）固定，同時(shí)使用同等規(guī)格的已應(yīng)用于臨床的聚消旋乳酸高分子Poly（DLlactide）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)PDLLA）全螺紋松質(zhì)骨螺釘作為對(duì)照，研究其固定骨端骨折的可行性、評(píng)估其生物相容性及生物力學(xué)性，為進(jìn)一步研發(fā)新型內(nèi)固定材料提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年比格犬9 只，雌雄不限，體重8～11 kg，單籠喂養(yǎng)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（東校區(qū)）提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2011-0029；使用許可證：SYXK（粵）2011-0112。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材（1）可吸收POC-click-HA 松質(zhì)骨螺釘。自行制備。電腦繪制螺釘草圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入機(jī)械加工軟件，連接數(shù)控機(jī)床，經(jīng)過(guò)車(chē)外圓、車(chē)外形、車(chē)螺紋、去毛剌等工序，獲得POC-click-HA 松質(zhì)骨螺釘，直徑5.5 mm，全長(zhǎng)55 mm，螺紋長(zhǎng)50 mm，初始強(qiáng)度＞60 Mpa，其彈性模量與松質(zhì)骨相當(dāng)。包裝好以鈷60輻射滅菌備用[17]。（2）可吸收骨折內(nèi)固定聚消旋乳酸（PDLLA）螺釘。成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司生產(chǎn)，環(huán)氧乙烷滅菌消毒。規(guī)格同上。（3）螺釘配套器械：推進(jìn)器、螺絲刀、測(cè)深尺、埋頭器、鉆頭、絲錐。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 手術(shù) 腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 ml/kg）進(jìn)行麻醉生效后，取側(cè)臥位將比格犬固定在手術(shù)操作臺(tái)上，備皮，常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)孔巾。自右膝關(guān)節(jié)外側(cè)入路，作一縱形手術(shù)切口，逐層切開(kāi)暴露至關(guān)節(jié)囊（保留髕韌帶），將髕骨向膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)推移使其脫位，進(jìn)一步暴露股骨內(nèi)、外髁。使用微型電鋸自上向下鋸斷股骨外髁（注意保留前后交叉韌帶），造成比格犬股骨外髁骨折模型（AO 分型為33.B1 型）。巾鉗復(fù)位骨折后，以直徑4.5 mm 鉆頭自股骨外側(cè)向內(nèi)側(cè)鉆孔，攻絲、測(cè)深后使用POC-click-HA 松質(zhì)骨螺釘固定骨折，螺釘穿透對(duì)側(cè)皮質(zhì)。生理鹽水和碘伏充分沖洗后，逐層關(guān)閉切口，無(wú)菌敷料包扎，腿部管形石膏固定。同法，造左側(cè)股骨外髁骨折模型，以同等規(guī)格PDLLA 螺釘固定骨折，見(jiàn)圖1。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，術(shù)后第1～3 d 予肌肉注射青霉素鈉160 萬(wàn)單位/次/日預(yù)防感染。

1.2.2 主要觀察指標(biāo)（1）一般情況及標(biāo)本大體觀察：觀察比格犬術(shù)后的精神狀態(tài)、行走步態(tài)、飲食及切口愈合情況（傷口有無(wú)開(kāi)裂、感染、竇道形成等）。（2）術(shù)后4 周、8 周、12 周處死3 只動(dòng)物切取標(biāo)本，對(duì)大體標(biāo)本進(jìn)行觀察并進(jìn)行骨折部位Lane-Sandhu 組織學(xué)評(píng)分。（3）生物力學(xué)測(cè)試：測(cè)試地點(diǎn)為南方醫(yī)科大學(xué)系統(tǒng)解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室，生物力學(xué)測(cè)試機(jī)器為Bose Electroforce，將標(biāo)本置于測(cè)試平板上，平板固定于機(jī)器底座。取直徑5 mm 的金屬棒垂直對(duì)準(zhǔn)松質(zhì)骨螺釘，使用計(jì)算機(jī)控制金屬棒從上往下移動(dòng)，推頂螺釘，電腦同步測(cè)量并記錄推出螺釘?shù)淖畲罅α?，即為界面?yīng)力最大載荷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。不同組間術(shù)后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比較采用析因方差分析法。P＜0.05 表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大體情況

2.1.1 動(dòng)物一般情況 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。術(shù)后精神、食量、活動(dòng)量逐漸恢復(fù)，1 周后即可緩慢步行，4～6 周后行走步態(tài)基本正常；傷口均愈合良好，未見(jiàn)明顯紅腫、膿液滲出、竇道形成等術(shù)后并發(fā)癥。

2.1.2 標(biāo)本觀察 術(shù)后按時(shí)間點(diǎn)取材，由標(biāo)本可見(jiàn)兩組骨折均固定牢固，無(wú)明顯移位。兩組螺釘螺帽周?chē)欣w維結(jié)締組織包裹，無(wú)充血、水腫及化膿等，關(guān)節(jié)面結(jié)締組織不多，較為平整。骨折愈合情況：4 周骨折線清晰可見(jiàn)，骨折縫隙內(nèi)充滿白色纖維組織；8 周骨折稍模糊，骨折縫隙內(nèi)仍有較多白色纖維組織；12周骨折線更為模糊，部分縫隙內(nèi)有少量纖維組織，有的甚至完全吸收，符合骨折愈合標(biāo)準(zhǔn)。矢狀位截面可見(jiàn)，術(shù)后12 周與術(shù)后8 周相比，螺釘與周?chē)墙M織結(jié)合更為緊密，POC-click-HA 組部分有新生骨組織從螺釘表面向內(nèi)部生長(zhǎng)（圖2）。

2.2 Lane-Sandhu 組織學(xué)評(píng)分

圖1 比格犬股骨外髁骨折（AO 分型33.B1 型）手術(shù)圖片A：材料外觀 黃色為POC-click-HA 材料，無(wú)色透明為PDLLA 材料 B：常規(guī)備皮、消毒、鋪巾 C：逐層切開(kāi) D：暴露股骨外髁 E：暴露股骨外髁，骨折造模成功F：鉆孔與攻絲 G：POC-click-HA 螺釘固定（白色箭頭） H：PDLLA 螺釘固定（黃色箭頭）I：術(shù)后腿部管型石膏固定Fig.1 Surgical picture for Beagle lateral femoral epicondyle fracture (AO classification type B1)A: configuration of the materials(yellow indicated POC-click-HA,transparent indicated PDLLA);B: skin preparation,disinfection,draping; C: incision; D:exposure of the lateral femoral epicondyle; E: success of the fracture modeling; F: drilling and tapping; G: fixation of the POCclick-HA screws (white arrows);H: fixation of the PDLLA screws(yellow arrows); I: tubular gypsum fixation post-operation

圖2 骨折內(nèi)固定術(shù)后標(biāo)本整體外觀及矢狀位截面圖A、B：12 周PDLLA 螺釘正、側(cè)位觀C、D：12 周POC-click-HA 螺釘正、側(cè)位觀E、F：8 周、12 周POC-click-HA 螺釘矢狀位截面G、H：8 周、12 周PDLLA 螺釘矢狀位截面Fig.2 Integral appearance of the specimen 12 weeks after the internal fixation and sagittal section of the specimen 8 weeks and 12 weeks after the internal fixation.A and B indicated anteroposterior view and lateral view of the PDLLA at 12 weeks; C and D indicated anteroposterior view and lateral view of the POC-click-HA at 12 weeks; E and F indicated sagittal section of POC-click-HA screws at 8 weeks and 12 weeks; G and H indicated sagittal section of PDLLA screws at8 weeks and 12 weeks

術(shù)后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)骨折部位進(jìn)行Lane-Sandhu 組織學(xué)評(píng)分，結(jié)果顯示：組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明隨著時(shí)間推移，兩組骨折被螺釘固定后均表現(xiàn)出良好的愈合。但在術(shù)后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組螺釘分別進(jìn)行對(duì)比，評(píng)分均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明POC-click-HA 螺釘與PDLLA 螺釘固定對(duì)骨折愈合效果無(wú)明顯差異（圖3）。

圖3 螺釘內(nèi)固定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)骨折部位Lane-Sandhu組織學(xué)評(píng)分圖*P＜0.05，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比Fig.3 Lane-Sandhu histologic grading pictures at different time point after the internal fixation*P＜0.05,compared at each time points in the group

2.3 螺釘-骨界面應(yīng)力載荷測(cè)試結(jié)果

使用生物力學(xué)測(cè)試機(jī)對(duì)兩組螺釘術(shù)后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的螺釘-骨界面最大應(yīng)力載荷進(jìn)行測(cè)量。兩組螺釘各自組內(nèi)對(duì)比：兩組均顯示組內(nèi)術(shù)后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釘-骨界面最大應(yīng)力載荷有差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明隨著時(shí)間增長(zhǎng)，螺釘與骨組織結(jié)合得更緊密。組間對(duì)比：將術(shù)后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的PDLLA 組與POC-click-HA 組螺釘-骨界面最大應(yīng)力載荷進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示4 周PDLLA 組載荷高于POC-click-HA組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；8 周和12 周，兩組釘-骨界面載荷對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明內(nèi)固定初期POC-click-HA 螺釘固定強(qiáng)度不及PDLLA 螺釘，但到了后期二者固定強(qiáng)度無(wú)明顯差別（圖4）。

3 討論

3.1 POC-click-HA 骨螺釘?shù)纳锵嗳菪?/h3>

本組前期研究合成多孔隙的檸檬酸組織工程支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)OC-click-HA 材料支架為BMSC 細(xì)胞的粘附提供了良好的附著點(diǎn)，BMSC 細(xì)胞活性良好，能進(jìn)一步生長(zhǎng)和分化，證明此類(lèi)聚檸檬酸復(fù)合生物材料的生物相容性和生物安全性[14～18]。在本實(shí)驗(yàn)，POC-click-HA松質(zhì)骨螺釘組比格犬切口未見(jiàn)紅腫、感染、縫線開(kāi)裂，無(wú)竇道形成，術(shù)后12 周未見(jiàn)遲發(fā)性炎癥反應(yīng)、釘?shù)乐車(chē)侨芙獾炔l(fā)癥，而且在后期可以看到螺釘和骨較好整合，說(shuō)明POC-click-HA 骨螺釘材料在中長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)周?chē)M織無(wú)明顯刺激，不引起異物排斥反應(yīng)，無(wú)毒性。

圖4 骨螺釘內(nèi)固定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)釘-骨界面最大應(yīng)力載荷圖*P＜0.05，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)對(duì)比及4 周組間對(duì)比Fig.4 Maximum stress load picture of the screw-bone tissue interface after the internal fixation at different time point*P＜0.05,compared at each time points in the group and compared at 4 weeks between the two groups

3.2 POC-click-HA 骨螺釘?shù)纳锪W(xué)強(qiáng)度

生物力學(xué)強(qiáng)度測(cè)試得到的螺釘-骨界面應(yīng)力實(shí)際上由兩種結(jié)合力量構(gòu)成-機(jī)械結(jié)合力和生物結(jié)合力[19]。前者指螺釘與骨組織之間的把持和嵌合力，在內(nèi)固定初期意義重大；后者指隨著時(shí)間推移，螺釘與骨組織整合的力量，在內(nèi)固定后期發(fā)揮更重要的作用。POCclick-HA 螺釘?shù)木窒拊谟跈C(jī)械結(jié)合力稍弱，因此術(shù)后4 周測(cè)得的螺釘-骨界面最大應(yīng)力載荷低于PDLLA 螺釘，推測(cè)原因有兩點(diǎn)：第一，PDLLA 螺釘植入骨組織后會(huì)產(chǎn)生自身徑向膨脹效應(yīng)而更牢固地把持骨組織，POC-click-HA 螺釘不具有這種特性；第二，與POCclick-HA 螺釘螺紋的分布、深度、間距等設(shè)計(jì)有關(guān)，進(jìn)一步改善螺釘有望獲得更好的把持力。而術(shù)后8 周、12 周測(cè)得的螺釘-骨界面最大應(yīng)力載荷兩組螺釘接近，原因可能是POC-click-HA 螺釘具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力和更好的降解性，使新生骨礦化并產(chǎn)生骨小梁，快速地與周?chē)墙M織發(fā)生整合，產(chǎn)生較強(qiáng)的生物結(jié)合力。因此能彌補(bǔ)機(jī)械結(jié)合力的不足，在術(shù)后8 周和12周表現(xiàn)出不遜于PDLLA 螺釘強(qiáng)度的界面應(yīng)力載荷。

3.3 POC-click-HA 骨螺釘?shù)膬?yōu)缺點(diǎn)

現(xiàn)用于臨床研究的生物可吸收材料主要有多聚乙醇酸（PGA）和多聚乳酸（PLA）。由于PGA 降解后產(chǎn)生酸性產(chǎn)物，降低周?chē)M織pH 值，引起骨溶解、異物反應(yīng)、無(wú)菌性骨囊腫等不良事件，而且螺釘機(jī)械強(qiáng)度下降過(guò)快，臨床已很少使用；PLA 是目前臨床應(yīng)用最廣泛的可吸收材料[20]。王毅等[21]采用PDLLA 可吸收舟骨螺釘在標(biāo)本內(nèi)的抗彎曲、抗拉伸強(qiáng)度及固定骨折的實(shí)際效果觀察，認(rèn)為該螺釘對(duì)手舟骨腰部骨折的固定效果較克氏針更理想，是一種可行的手舟骨骨折固定材料。秦金橋等[22]研究認(rèn)為PDLLA 混合殼聚糖可吸收髓內(nèi)釘在多指再植指骨固定方面較克氏針有明顯的優(yōu)勢(shì)。還有研究表明PLA 螺釘在踝關(guān)節(jié)骨折、下脛腓骨聯(lián)合損傷中應(yīng)用取得良好臨床效果[23,24]。但PLA 降解時(shí)間長(zhǎng)，不利于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的細(xì)胞粘附限制了它的應(yīng)用[20]。而POC-click-HA 材料最大優(yōu)點(diǎn)是具有和骨組織相同成分的檸檬酸，還具有誘導(dǎo)成骨的作用[14～18]，因此它的組織相容性更好，從圖2 可見(jiàn)POC-click-HA 螺釘與骨組織整合更強(qiáng)，術(shù)后12 周已部分降解融合，這也是術(shù)后8 周和12 周兩組釘-骨界面載荷對(duì)比無(wú)顯著差異的原因（圖3）。但POC-click-HA 螺釘?shù)娜秉c(diǎn)是初始生物力學(xué)強(qiáng)度較PDLLA 螺釘弱，對(duì)骨折早期固定缺乏加壓作用，表現(xiàn)為4 周時(shí)POC-click-HA 釘?shù)妮d荷低于PDLLA 組（圖4）。

總而言之，POC-click-HA 螺釘在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出良好的生物相容性，且具有一定力學(xué)強(qiáng)度，對(duì)于比格犬股骨外髁B1 型骨折具有較好的內(nèi)固定作用。本組下一步的工作是通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)進(jìn)一步評(píng)估POC-click-HA 螺釘在體內(nèi)的降解性及誘導(dǎo)成骨性，并探討其作用機(jī)制，進(jìn)而優(yōu)化材料的組成和結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)力學(xué)強(qiáng)度，使其能成為一種新型的可吸收骨折內(nèi)固定材料。