曲古抑菌素A通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡

張海燕，孫麗慧，潘洪明，李林，廉潔，于晶，郎尉雅

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161000

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，是女性癌癥疾病導(dǎo)致死亡的最主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年有超過(guò)200 萬(wàn)例新發(fā)病例，約占女性癌癥總數(shù)的四分之一[1]。乳腺癌的發(fā)生與性激素水平、轉(zhuǎn)錄因子的異常調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡的異常調(diào)控等多種因素密切相關(guān)[2]。

曲古抑菌素A(TSA)隸屬異羥肟酸類(lèi)化合物，是目前被認(rèn)為最有效的組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)之一。研究表明，TSA 具有抗卵巢癌、肺癌細(xì)胞、前列腺癌等腫瘤的能力，可抑制細(xì)胞增殖，其發(fā)生機(jī)制可能與調(diào)控下游相關(guān)信號(hào)通路基因表達(dá)有關(guān)[3～5]。以往TSA 抗腫瘤作用多集中于對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用的影響，而TSA對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制研究尚不十分明確。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞，采用MTT 法、流式細(xì)胞術(shù)與Western Blot 法、RT-PCR 半定量檢測(cè)等方法探究TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響及其分子作用機(jī)制，為乳腺癌尋找和開(kāi)發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231 購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；抑制劑SP600125 購(gòu)自于CSN 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自于Gibco 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；曲古抑菌素A、四甲基亞唑藍(lán)(MTT)、DMSO、DAPI 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；細(xì)胞周期染色液、Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；一抗Cyclin D1、P21、Cdk4、Caspase-3、Bcl-2、Bax、MAPK 家族抗體試劑盒、磷酸化MAPK 家族抗體試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、ECL 顯影液購(gòu)自BIO-RAD 公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、6 孔板、96 孔板等購(gòu)自于美國(guó)Corning 公司；PBS、無(wú)水乙醇等購(gòu)自北京天根生化技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素、100 mg/L 青霉素)，37 ℃飽和濕度，濃度為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48h 傳代1 次，并且選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為備用。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞懸液按密度為5×104/ml 接種于96 孔板，每孔體積200 μl，置于37 ℃，飽和濕度及5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄上清，向各組細(xì)胞內(nèi)分別加入含0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L TSA 的完全培養(yǎng)基，并在藥物作用24、48、72、96 h 后，向每孔加入20 μl、濃度為5 mg/ml 的MTT，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)定3 個(gè)平行孔，將其放置在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h 后，去上清，加入200 μl、濃度為10%二甲基亞砜（DMSO），過(guò)夜。采取全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 的光密度值。其細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=1－實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值×100%。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆能力

將TSA 處理后72 h 的各組細(xì)胞接于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入200 個(gè)細(xì)胞，接種10 d 后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆，以甲醇固定，用結(jié)晶紫染色，放在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)目，按集落形成率=每組細(xì)胞集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞集落(細(xì)胞數(shù)＞50 個(gè))及集落形成率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞懸液按密度為5×105/ml 接種于6 孔板，每孔體積1 ml，置于37 ℃，飽和濕度及5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄上清，向各組細(xì)胞內(nèi)分別加入含0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L TSA 的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置3 個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，離心管收集細(xì)胞，1200 rpm 離心5 min，棄上清；用PBS 清洗一次，再次棄上清，加入1.5 ml PBS 重懸細(xì)胞。將重懸細(xì)胞加入預(yù)冷（-20 ℃）70%的乙醇，4 ℃固定過(guò)夜。細(xì)胞固定后，400 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，棄上清，每管內(nèi)加入500 μl 綜合染液（含50 μg/ml PI，100 μg/ml RNase A，0.2% Triton X-100），避光室溫孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后（同流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期），將重懸細(xì)胞1200 rpm 離心5 min，棄上清，加入1×Binding buffer 500 μl 重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫孵育10 min。再次將細(xì)胞1200 rpm 離心5 min，棄上清，加入1×Binding buffer 500 μl 重懸細(xì)胞，加入10 μl PI，輕輕混勻，冰浴避光孵育10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡情況，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡、信號(hào)通路蛋白

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞懸液按密度為5×105/ml 接種于直徑25 cm2的培養(yǎng)皿中，每皿體積3 ml，置于37 ℃，飽和濕度及5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，棄上清，向各組細(xì)胞內(nèi)分別加入含0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L TSA 的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)平行皿，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，各組加入細(xì)胞裂解液，靜置冰上裂解30 min，12000 rpm 離心30 min，取上清，采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。處理蛋白后上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳分離總蛋白，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Cyclin D1、Caspase-3、Bax、Bcl-2、p-P38、p-ERK、p-JNK 等一抗孵育過(guò)夜，PBST 漂洗3×5 min，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，PBS 漂洗3×5 min，ECL 法顯影，結(jié)果采用Bio-Rad 提供的Quantity One 軟件圖像進(jìn)行OD 值定量分析。

1.8 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡、信號(hào)通路蛋白mRNA 的表達(dá)水平

設(shè)計(jì)并合成引物，Cyclin D1 基因引物序列為:5′-CCCACTCCTACGATACGC-3′ (上游),5′-AGCCTC CCAAACACCC-3′(下游);CDK4 引物序列為：5′-ATGCTACCTCTCGAATGAGCCA-3′ (上游),5′-TCACTCCGGATTACCTTCAT-3′(下游);P21 引物序列為：5′-GGTGTCTAGGTGCTCCAGGT-3′(上游),5′-GCACTCTCCAGGAGGACACA-3′(下游);Caspase-3引物序列為：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC-3′(上游),5′-AGGACTCAAATTCTGTTGCCACC-3′(下游);Bcl-2 引物序列為：5′-TTCTTTGAGTTCGG TGGGGT-3′(上 游),5′-TGCATATTTGTTTGGGGCA GG-3′(下游)；Bax 引物序列為：5′-TCCACCAAGAA GCTGAGCGAG-3′(上游),5′-GTCCAGCCCATGAT GGTTCT-3′(下游)，引物由英淮捷基貿(mào)易有限公司負(fù)責(zé)合成。RNA 抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)260、280 nm 處的OD 值，確定所提RNA 的濃度和純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板，使用Roche 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，以Actin 基因用于校正結(jié)果的內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TSA 呈劑量依賴(lài)性的抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖

MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組分別采用0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞24、48、72、96 h 后，不同濃度TSA 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用均在72 h 最強(qiáng)（同一濃度組內(nèi)比較：與前一時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.05），72 h 后其抑制作用未再增加。同時(shí)，在TSA 處理細(xì)胞72 h 時(shí)，隨濃度的增大其抑制作用逐漸增強(qiáng)，濃度為0.8 μmol/L 時(shí)抑制作用最強(qiáng)（同一時(shí)間組間比較，P＜0.05），繼續(xù)增加濃度抑制作用無(wú)顯著效果；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著TSA濃度增大，細(xì)胞集落形成率降低，細(xì)胞克隆能力減弱，濃度為0.8 μmol/L 時(shí)克隆能力作用最弱（P＜0.05），繼續(xù)增加濃度抑制作用無(wú)顯著效果；結(jié)果表明TSA 呈劑量依賴(lài)性抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖，且作用72 h、濃度為0.8 μmol/L 產(chǎn)生最大的抑制效應(yīng)(圖1)。

圖1 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響組間比較：同一時(shí)間點(diǎn)，與TSA 0.8 μmol/L 比較，*為P＜0.05；組內(nèi)比較：與前一時(shí)間點(diǎn)比較，*為P＜0.05Fig.1 The effect of TSA on cell growth in breast cancer MDA-MB-231Comparison between group:compared with TSA 0.8 μmol/L at same time point,*P＜0.05;Comparison in group:compared with previous time point,*P＜0.05

2.2 TSA 可使乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞阻滯于G1期

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組分別采用0.2、0.4、0.8 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞72 h 后，各組G1 期細(xì)胞所占比例分別為顯著高于對(duì)照組（0 μmol/L）G1 期細(xì)胞所占比例，且對(duì)應(yīng)各組S 期細(xì)胞所占比例顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明TSA 可使乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯于G1 期（圖2）。

2.3 TSA 呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組分別采用0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞72 h 后，各組的細(xì)胞總凋亡率(包括早期凋亡和晚期凋亡)顯著高于對(duì)照組（0 μmol/L）細(xì)胞總凋亡率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨濃度的增大細(xì)胞總凋亡率逐漸增高，濃度為0.8 μmol/L 時(shí)總凋亡率最高，繼續(xù)增加濃度總凋亡率無(wú)顯著增加(同0.8 μmol/L 組比較，P＞0.05)。表明TSA 呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)MDA-MB-231 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且濃度為0.8 μmol/L 產(chǎn)生最大誘導(dǎo)作用（圖3）。

2.4 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞Cyclin D1、Cdk4、P21、Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：0.2、0.4、0.8 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞72h 后，與對(duì)照組比較，各組Cyclin D1、Cdk4、Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而P21、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。表明TSA 可調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞G1 期相關(guān)蛋白及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖4）。

2.5 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞Cyclin D1、Cdk4、P21、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的影響

圖2 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組相比，*P＜0.05Fig.2 The effect of TSA on cell cycle in breast cancer MDA-MB-231 Compared with the control group *P＜0.05

圖3 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，*P＜0.05Fig.3 The effect of TSA on cell apoptotic in breast cancer MDA-MB-231 cells Compared with the control group *P＜0.05

qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白mRNA結(jié)果顯 示：0.2、0.4、0.8 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞72 h 后，與對(duì)照組比較，各組Cyclin D1 mRNA、Cdk4 mRNA、Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而P21 mRNA、Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。表明TSA 可調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞G1 期相關(guān)蛋白及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA 的表達(dá)（圖4）。

2.6 TSA 可能通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖與凋亡

Western blot 檢測(cè)MAPK 信號(hào)通路下游重要分子P38、ERK、JNK 磷酸化水平結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組采用0.2、0.4、0.8 μmol/L 的TSA 處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞72 h 后，p-P38、p-ERK 在TSA 濃度為0.2 μmol/L時(shí)表達(dá)增高，后表達(dá)稍微降低，各組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而p-JNK 蛋白表達(dá)呈濃度依賴(lài)性上調(diào)，各組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明TSA 可通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖和凋亡，而不是P38、ERK 通路（圖5）。

2.7 抑制JNK/MAPK 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

圖4 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及mRNA 的影響A：WB 檢測(cè)蛋白表達(dá) B：WB 檢測(cè)蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖 C：qRT-PCR 檢測(cè)mRNA 統(tǒng)計(jì)圖與對(duì)照組相比，*P＜0.05Fig.4 The effect of TSA on cell cycle protein,apoptotic protein and mRNA expression in breast cancer MDA-MB-231A:WB detection of protein expression；B:the cartogram of WB；C:the cartogram of qRT-PCR Compared with the control group *P＜0.05

圖5 TSA 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞MAPK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，*P＜0.05Fig.5 The effect of TSA on MAPK signaling pathway protein expression in breast cancer MDA-MB-231 Compared with the control group *P＜0.05

圖6 抑制劑SP600125 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控 與TSA 0.8μmol/L 組相比，*P＜0.05Fig.6 The effect of inhibitor SP600125 on cell cycle and apoptotic in breast cancer MDA-MB-231 Compared with TSA 0.8μmol/L group *P＜0.05

圖7 抑制劑SP600125 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞周期及凋亡蛋白及mRNA 表達(dá)的影響與TSA 0.8μmol/L 組相比，*P＜0.05A：WB 檢測(cè)蛋白表達(dá) B：WB 檢測(cè)蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖 C：qRT-PCR 檢測(cè)mRNA 統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 The effect of inhibitor SP600125 on cell signaling pathway,cell cycle protein,apoptotic protein and mRNA expression in breast cancer MDA-MB-231 Compared with TSA 0.8μmol/L group *P＜0.05A:WB detection of protein expression B:the cartogram of WB C:the cartogram of qRT-PCR

為驗(yàn)證TSA 是否通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡，采用小分子抑制劑SP600125 抑制JNK 通路，實(shí)驗(yàn)分為四組：對(duì)照組（TSA 0 μmol/L）；TSA 0.8 μmol/L 組；SP600125 組；TSA 0.8 μmol/L+SP600125 組。MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示：與TSA 0.8 μmol/L 組比較，TSA 0.8 μmol/L+SP600125 組細(xì)胞增殖無(wú)顯著減少（P＞0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡結(jié)果顯示：與TSA 0.8 μmol/L 組比較，TSA 0.8 μmol/L+SP600125 組細(xì)胞周期中各期細(xì)胞比率無(wú)顯著差異（P＞0.05），但總凋亡率顯著降低（P＜0.05）（圖6）；Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：與TSA 0.8μmol/L 組比較，TSA 0.8μmol/L +SP600125 組Cyclin D1、Cdk4、P21 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著改變（P＞0.05），但p-JNK、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白mRNA 結(jié)果顯示：與TSA 0.8 μmol/L 組比較，TSA 0.8μmol/L+SP600125 組Cyclin D1、Cdk4、P21 mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著改變（P＞0.05），但p-JNK、Caspase-3、Bax mRNA 表達(dá)水平顯著 降低，Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TSA 通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡，但不介導(dǎo)細(xì)胞增殖。

3 討論

乳腺癌是目前威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一，其具有高度異質(zhì)性、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、耐藥反應(yīng)強(qiáng)、高轉(zhuǎn)移性等特點(diǎn)。惡性腫瘤的發(fā)生主要是由于細(xì)胞周期異常調(diào)控而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖異常、分化受阻、凋亡異常所致[6]。組蛋白去乙酰化酶（(histone deacetylase，HDACs）通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；剑S持細(xì)胞及有機(jī)體內(nèi)組蛋白的乙?；腿ヒ阴；g保持動(dòng)態(tài)平衡，從而控制染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；@對(duì)平衡發(fā)生紊亂與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[7-8]。HDACIs是近年來(lái)備受到關(guān)注的一類(lèi)新型抗腫癌藥物，其靶向性強(qiáng)、毒性較低，較傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物具有明顯優(yōu)勢(shì)[9]。TSA 主要通過(guò)其氧肟酸螯合HDAC 活化位點(diǎn)的鋅離子而抑制HDAC 酶活性，增加抑癌基因的表達(dá)，而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡[10]。不同結(jié)構(gòu)的HDACIs 對(duì)不同的細(xì)胞系的作用機(jī)制不同，且同一種細(xì)胞對(duì)不同的HDACIs 的反應(yīng)也不相同[10,11]。

我們利用乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞研究TSA 對(duì)惡性腫瘤的分化作用，結(jié)果顯示TSA 呈劑量依賴(lài)性抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步對(duì)TSA 對(duì)抑制乳腺癌細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行研究。細(xì)胞周期阻滯和程序性細(xì)胞死亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮藥理作用的重要機(jī)制[12]。為表明TSA 是否誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示TSA 可使乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞周期阻滯于G1 期。細(xì)胞增殖與分化是由細(xì)胞周期中的G1 期所調(diào)控，且參與G1 期調(diào)控的細(xì)胞周期蛋白中，Cyclin D1 與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Cdk4 是一種細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶，其在G1期表達(dá)水平升高，Cyclin D1 與Cdk4 結(jié)合進(jìn)入胞核，激活下游途徑，啟動(dòng)細(xì)胞DNA 復(fù)制，能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1 期向S 期轉(zhuǎn)變[13-14]。Cdk4 活性的高低受到細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子如P21 的調(diào)控，P21 具有抑制細(xì)胞周期進(jìn)展作用。我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TSA 可使Cyclin D1、Cdk4蛋白表達(dá)下調(diào)，且上調(diào)P21 蛋白表達(dá)，這表明TSA 抑制細(xì)胞增殖，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白等表達(dá)使細(xì)胞阻滯于G1 期。

細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡被打破，也可引發(fā)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸。為此，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示TSA 呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)MDA-MB-231 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由多種因子或蛋白參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白間的相互作用是引起細(xì)胞凋亡的主要因素。我們進(jìn)一步從蛋白水平探討，Western blot 檢測(cè)顯示，TSA 可使抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低，而促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達(dá)顯著升高。Bax、Bcl-2 共屬于Bcl-2 基因家族，Bcl-2 是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax 不僅拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用，而且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，Caspase-3 是凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。正常情況下，Bcl-2 和Bax 二者蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，而當(dāng)Bcl-2 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)降低時(shí)，與Bax 形成異源二聚體減少，Bax 的轉(zhuǎn)位及同源二聚體形成增多，Bcl-2 和Bax 可作為Caspase-3 上游調(diào)控機(jī)制，使Caspase-3 表達(dá)增多，而啟動(dòng)Caspase 家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞死亡的反應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)，促使發(fā)生凋亡[15,16]。

MAPK 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的重要通路，主要是通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)激活，將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種生理過(guò)程。多項(xiàng)研究證實(shí)，MAPK 信號(hào)通路異常激活與宮頸癌、卵巢癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤相關(guān)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在四條MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路，即ERK、JNK、P38、ERK5通路，當(dāng)細(xì)胞接收到外界刺激信號(hào)時(shí)，可激活ERK、P38 MAPK、JNK 信號(hào)通路中的部分或全部，既可獨(dú)立作用也可協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[17,18]。P38/MAPK通路可參與Hela 宮頸癌細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞遷移及侵襲能力；JNK/P38 MAPK 信號(hào)通路參與卵巢癌SKOV3 細(xì)胞生存及運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)控[19,20]。為進(jìn)一步探究TSA 調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡可能的作用機(jī)制，我們通過(guò)Western blot 檢測(cè)MAPK 信號(hào)通路下游重要分子P38、ERK、JNK 磷酸化水平，TSA 作用后，與對(duì)照組比較，p-P38、p-ERK 蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，而p-JNK 蛋白表達(dá)呈濃度依賴(lài)性上調(diào)，表明TSA 可通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞增殖和凋亡，而不是P38、ERK 通路。進(jìn)而我們采用小分子抑制劑SP600125 抑制JNK 通路，結(jié)果顯示加入抑制劑后，與對(duì)照組比，抑制劑組細(xì)胞增殖及周期蛋白未發(fā)生顯著改變，而細(xì)胞總凋亡率降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 顯著增多，促凋亡蛋白Caspase-3、Bax 表達(dá)水平顯著降低，表明TSA 通過(guò)JNK/MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡，但不介導(dǎo)細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究通過(guò)MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot 等研究技術(shù)表明，TSA 可引起乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞發(fā)生G1 期阻滯從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖；同時(shí)，TSA 可通過(guò)激活JNK/MAPK 信號(hào)通路，誘導(dǎo)凋亡蛋白水平的改變，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的凋亡。提示TSA 為乳腺癌的治療和預(yù)后提供新的治療靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究TSA 促進(jìn)乳腺癌和其他癌癥進(jìn)展的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。