幾丁質(zhì)降解菌的分離鑒定與產(chǎn)酶條件探究

王 敏，辛二娜，王 瑤，張?zhí)鞂?，郭繼虎，杜慧玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西太谷030801）

幾丁質(zhì)（Chitin），又稱甲殼素，是微生物、綠色植物細胞壁以及甲殼類動物外殼的主要成分[1-2]，是纖維素之外的第二大天然大分子物質(zhì)，也是自然界唯一的堿性多糖[3-4]。幾丁質(zhì)降解后形成的N- 乙酰氨基葡萄糖、幾丁寡糖等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗蟲害、保濕等生物學(xué)功能，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、化妝品等行業(yè)具有較大的應(yīng)用價值[5-7]。

幾丁質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，很難被有效利用。目前，降解幾丁質(zhì)的常用方法有化學(xué)法和酶解法。其中，化學(xué)法反應(yīng)條件劇烈，產(chǎn)物聚合度差，容易破壞環(huán)境；酶解法反應(yīng)條件溫和，便于操作，是一種理想的、綠色的降解幾丁質(zhì)的方法[8-9]。1905 年BENECKEU 首次從幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌中分離發(fā)現(xiàn)了一類將幾丁質(zhì)降解為N- 乙酰氨基葡萄糖單體的幾丁質(zhì)酶[10]。隨著人們對幾丁質(zhì)酶研究的深入，現(xiàn)已在許多微生物中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶[11]。劉蒲臨等[12]從側(cè)孢短芽孢桿菌分離出幾丁質(zhì)酶，并對其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。陳立功等[13]從渤海海域淤泥中篩選出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的發(fā)光桿菌。王曉輝等[14]從黃河沿岸的土壤中分離出1 株降解幾丁質(zhì)的地衣芽孢桿菌。郝之奎等[15]從浙江劍門港海區(qū)淤泥中篩選出幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定其為芽生桿菌。

隨著資源昆蟲的開發(fā)與利用、黃粉蟲飼養(yǎng)規(guī)模的擴大，在為人們帶來巨大效益的同時，產(chǎn)生了大量難以被利用的黃粉蟲蟲蛻，而黃粉蟲蟲蛻的主要成分是幾丁質(zhì)[16]。

本研究以自然條件下填埋黃粉蟲蟲蛻1 a 的土壤為材料，采用透明圈法初篩和搖瓶復(fù)篩獲得1 株產(chǎn)酶活性較高的菌株，并對其進行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定及最佳產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化，旨在為酶解法降解幾丁質(zhì)提供理論和實踐指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 供試菌種來源于自然條件下填埋黃粉蟲蟲蛻1 a 的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 幾丁質(zhì)培養(yǎng)基100 mL：膠體幾丁質(zhì)20 mL、KH2PO40.03 g、K2HPO40.07 g、FeSO40.001 g、MgSO40.05 g、NH4Cl 0.01 g、NaCl 0.01 g、瓊脂2 g、水80 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL：KH2PO40.03 g、K2HPO40.07 g、FeSO40.001 g、MgSO40.05 g、膠體幾丁質(zhì)20 mL、NH4Cl 0.01 g、NaCl 0.01 g、水80 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的篩選 初篩。稱取10.0 g土壤于250 mL三角瓶，加入90 mL 無菌水，在30 ℃、180 r/min 條件下振蕩180 min；然后將此土壤懸濁液依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的濃度，取10-5、10-6、10-7濃度的土壤稀釋液各200 μL 涂布于幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，挑取有透明圈的單菌落進行平板劃線培養(yǎng)。

復(fù)篩。挑取等量的一環(huán)新鮮的幾丁質(zhì)降解菌的單菌接種于等量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min條件下，恒溫培養(yǎng)48 h 后，用鐵氰化鉀（Sachales）法[17]測定酶活，取酶活性最高者作為目標菌種。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將目標菌種分別劃線培養(yǎng)和點接在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài)特征，培養(yǎng)7 d 后觀察菌落周圍的透明條帶。參照劉春爽等[18]的方法，對菌株進行革蘭氏染色反應(yīng)，光學(xué)顯微鏡（400×）下進行觀察。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 提取菌株總DNA，用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物擴增菌株的16S rDNA 序列。PCR 反應(yīng)體系為：DNA 20 ng/μL、Taq聚合酶5 U/μL、dNTP（10 mmol/L）各1 μL，27F 引物、1492R 引物各1.5 μL，10×Buffer 5 μL，加ddH2O 至50 μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min，于4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，將測序結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株產(chǎn)酶條件探究 對菌株的培養(yǎng)條件如發(fā)酵時間、裝液量、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、碳源及其添加量等進行單因素試驗，采用鐵氰化鉀法[17]測定酶活，探究菌株產(chǎn)酶的最佳條件。

1.2.4.1 發(fā)酵時間 將幾丁質(zhì)降解菌接種到裝液量為30 mL，pH 值7，2 g/L 的膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的150 mL 三角瓶中，置于30 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)120 h，期間每隔12 h 測定一次酶活。

1.2.4.2 裝液量 在最佳培養(yǎng)時間下，將幾丁質(zhì)降解菌接種到裝液量分別為10、20、30、40、50、60 mL的150 mL 三角瓶，其他培養(yǎng)條件同1.2.4.1，并測定酶活。

1.2.4.3 培養(yǎng)基pH 值 在最佳培養(yǎng)時間和裝液量條件下，將幾丁質(zhì)降解菌接種到pH 值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的培養(yǎng)基上，其他培養(yǎng)條件同1.2.4.1，并測定酶活。

1.2.4.4 培養(yǎng)溫度 在最佳培養(yǎng)時間、裝液量和pH條件下，將幾丁質(zhì)降解菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，分別在10、20、30、40、50 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件同1.2.4.1，并測定酶活。

1.2.4.5 碳源種類 在最佳培養(yǎng)時間、裝液量、pH值和培養(yǎng)溫度條件下，將幾丁質(zhì)降解菌接種到分別以2 g/L 細粉幾丁質(zhì)、羧甲基纖維素、蔗糖、N- 乙酰氨基葡萄糖、膠體幾丁質(zhì)、可溶性淀粉、葡萄糖等為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上，測定酶活。

1.2.4.6 碳源添加量 在以上最佳條件下，將幾丁質(zhì)降解菌接種到膠體幾丁質(zhì)添加量分別為1、2、4、6、8、10 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)測定酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Microsoft Office 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)降解菌的篩選和形態(tài)學(xué)觀察

初篩得到3 株有透明圈的菌落（圖1-A），經(jīng)過純化得到1 株產(chǎn)酶能力良好、酶活為0.026 U/mL 的菌株，將該菌株命名為Wn；培養(yǎng)48 h 后，在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上對菌株Wn 進行觀察，結(jié)果顯示，其為圓形菌落，表面光滑，半透明，中心凸起，易于挑起（圖1-B）；培養(yǎng)7 d 后，在幾丁質(zhì)培養(yǎng)基平板上，Wn 單菌落周圍可見明顯的透明圈（圖1-C）；該菌株經(jīng)革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡（400×）下觀察呈紫色，有芽孢，確定為革蘭氏陽性菌（圖1-D）。

2.2 幾丁質(zhì)降解菌的分子生物學(xué)鑒定

以菌株Wn 的16S rDNA 序列為基礎(chǔ)，PCR 產(chǎn)物（圖2-A）可見Wn 的16S rDNA 序列在1 000～2 000 bp。測序結(jié)果通過在NCBI 上BLAST 比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2-B 所示，Wn 菌株和類芽孢桿菌的匹配率最高，同源性在99%以上，鑒定菌種Wn 為類芽孢桿菌屬（Paenibacillussp.）。

2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

6 個產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化結(jié)果表明（圖3），培養(yǎng)96 h 時菌株酶活最大，為0.065 U/mL；裝液量為50 mL，達1/3 時酶活最大，約0.072 U/mL；pH 值為7.5 時酶活最大，約0.073 U/mL，且與pH 值為8 時的酶活差異不顯著；溫度為30 ℃時的酶活最大，為0.074 U/mL；以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的酶活最大，為0.077 U/mL；碳源添加量為8 g/L 時酶活最大，為0.155 U/mL，且與添加量為10 g/L 時的酶活差異不顯著?？傮w來看，除碳源種類外，其余5 個單因素試驗中酶活均隨變量的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由菌株培養(yǎng)時間可知，培養(yǎng)96 h 后菌株產(chǎn)酶能力逐漸減小，這可能是因為隨著培養(yǎng)時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，不能滿足菌株大量繁殖的需要；從適宜裝液量和pH 可見Wn 為需氧型菌種，且在微堿性環(huán)境種產(chǎn)酶效果好；不同種類的碳源對產(chǎn)酶能力的影響表明，幾丁質(zhì)酶是誘導(dǎo)酶，而且酶活性與幾丁質(zhì)的狀態(tài)有關(guān)，膠體幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)效果大于細粉幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)效果。

3 結(jié)論與討論

從黃粉蟲中提取的幾丁質(zhì)及加工后的產(chǎn)品無毒害性，是一種環(huán)保材料[19]。但養(yǎng)殖廢棄物中黃粉蟲蟲蛻的幾丁質(zhì)因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定而難被有效利用，自然環(huán)境填埋的黃粉蟲蟲蛻的降解主要由微生物來完成，因此推測填埋黃粉蟲蟲蛻的土壤中存在著產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株。本研究從填埋黃粉蟲蟲蛻的土壤中篩選幾丁質(zhì)降解菌Wn，通過擴增菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定其為類芽孢桿菌屬。與研究發(fā)現(xiàn)蟹殼土壤中[20]和玉米秸稈中[21]篩選到的幾丁質(zhì)降解菌多為芽孢桿菌屬的結(jié)果一致。

對黃粉蟲蟲蛻廢棄物的利用，不僅要求篩選到優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)酶菌種，還需要對該菌種的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，最大程度地挖掘其產(chǎn)酶潛力。本試驗通過單因素試驗得出，當(dāng)菌株發(fā)酵的裝液量為50 mL，達1/3、添加8 g/L 的膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源、pH 值7.5、置于30 ℃恒溫發(fā)酵96 h 時的酶活性最大，為0.155 U/mL。袁淑博等[22]研究發(fā)現(xiàn)，黏質(zhì)沙雷氏菌MEW06 在pH 值7、溫度31 ℃、以8 g/L 的膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源、培養(yǎng)48 h 時，菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活力最高。苗飛等[23]篩選出1 株幾丁質(zhì)降解菌WY產(chǎn)酶的最適條件為培養(yǎng)溫度40 ℃、培養(yǎng)時間72 h、培養(yǎng)基中膠體幾丁質(zhì)含量1.62%。本試驗研究結(jié)果與前人存在一定差異，可能與菌株的來源等因素有關(guān)。此外，幾丁質(zhì)酶活性測定的方法、選用的底物不同，所報道的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的酶活性大小也不盡相同[24]。有研究表明，最優(yōu)條件下培養(yǎng)的鞘氨醇桿菌J4 和芽孢桿菌J17 酶活分別可達5.43、4.8 U/mL[25]；枯草芽孢桿菌BS-1 優(yōu)化培養(yǎng)后酶活為3.23 U/mL[21]；嗜水氣單胞菌SWCH-6 酶活最高可達0.39 U/mL[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶是一類差異較大的水解酶類，隨菌種來源不同，酶學(xué)性質(zhì)存在一定的差異[27]。幾丁質(zhì)酶對底物的親和力不同，本試驗測定酶活力選用的底物是膠體幾丁質(zhì)，還需進一步使用黃粉蟲蟲蛻為底物，測定菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對黃粉蟲蟲蛻的降解效果。利用幾丁質(zhì)酶直接降解黃粉蟲蟲蛻，制備幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物，才能真正地實現(xiàn)黃粉蟲蟲蛻廢棄物的資源化利用。有研究表明，幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物如幾丁寡糖可以抑制植物病原菌[28]。因此，可以嘗試將該菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和黃粉蟲蟲蛻共同施入大田，研究生防菌劑來達到生物防治植物病害的目的。

本試驗從填埋黃粉蟲蟲蛻的土壤中篩選到1 株類芽孢桿菌Wn，在以8 g/L 的膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源、裝液量達1/3（50 mL/150 mL）、pH 值7.5、溫度為30 ℃的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96 h 時酶活性最大。但該菌株最高酶活性相比其他細菌產(chǎn)酶能力偏弱，僅為0.155 U/mL，推測可能是由于單因素試驗不能考慮到菌株培養(yǎng)條件的各因素之間的交互作用，得出的最佳培養(yǎng)條件并不是該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件，還需根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計原理繼續(xù)優(yōu)化該菌株的培養(yǎng)條件，也可通過基因工程優(yōu)化菌種以提高產(chǎn)酶能力[29-30]，故幾丁質(zhì)酶的純化、功能基因的克隆與構(gòu)建表達載體有待進一步研究。