外源5氨基乙酰丙酸(ALA)對低溫脅迫下枇杷葉片AsAGSH循環(huán)的影響

曹碧珍

摘 要：采用不同質(zhì)量濃度（100、150、175 mg·L-1）的5氨基乙酰丙酸（ALA）處理低溫脅迫下3年生的早鐘6號枇杷容器苗，以噴施清水為對照（CK），在-3℃下低溫脅迫處理3 h，比較分析不同處理對枇杷葉片過氧化氫（H2O2）、抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量及脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的影響。結(jié)果表明：與CK相比，外源ALA處理的枇杷葉片顯著促進了葉片中抗壞血酸（AsA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量的增加及脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的上升，降低過氧化氫（H2O2）含量。說明外源ALA處理促進了低溫脅迫下枇杷葉片AsA-GSH的有效循環(huán)，增強細胞的抗氧化性，提高枇杷幼苗的耐寒性。說明適當外源5氨基乙酰丙酸（ALA）處理能夠調(diào)控枇杷葉片中AsAGSH循環(huán)，進而提高枇杷葉片的抗寒性，減輕枇杷在低溫脅迫下的損傷，其中以175 mg·L-1ALA處理效果最顯著。

關(guān)鍵詞：5氨基乙酰丙酸;枇杷;低溫脅迫;AsAGSH循環(huán)

中圖分類號：S 667.3 ??文獻標志碼：A ??文章編號：0253-2301（2021）11-0007-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.11.002

Effects of Exogenous 5aminolevulinic Acid （ALA） on the AsA-GSHCirculation in Loquat Leaves Under the Stress of Low Temperature

CAO Bi-zhen

（Putian Xialin Sub-District Office of People′s Government of Chengxiang District， Putian， Fujian 351100， China）

Abstract： Different concentrations of 5aminolevulinic acid （ALA） （100， 150， 175 mg·L-1） were used to treat the three-year-old Zaozhong No.6 loquat container seedlings under the stress of low temperature. With spraying water as the control （CK）， the effects of different treatments on the contents of hydrogen peroxide （H2O2）， ascorbic acid （AsA） and reductive glutathione （GSH） and the activities of dehydroascorbate reductase （DHAR）， glutathione reductase （GR）， monodehydroascorbate reductase （MDHAR） and ascorbate peroxidase （APX） in the leaves of loquat were compared and analyzed when applying the low temperature stress at -3℃ for 3 h. The results showed that： compared with CK， the exogenous treatment with ALA on the leaves of loquat significantly promoted the increase of the contents of ascorbic acid （AsA） and reductive glutathione （GSH）， and the activities of dehydroascorbate reductase （DHAR）， monodehydroascorbate reductase （MDHAR）， glutathione reductase （GR） and ascorbate peroxidase （APX） in loquat leaves， but reduced the content of hydrogen peroxide （H2O2）. This indicated that the exogenous treatment with ALA promoted the effective circulation of AsA-GSH in loquat leaves under the stress of low temperature， enhanced the antioxidant activities of cells， and improved the cold tolerance of loquat seedlings. Therefore， the appropriate exogenous treatment with 5aminolevulinic acid （ALA） could regulate the AsA-GSH circulation in loquat leaves， thus improving the cold resistance of loquat leaves and reducing the damage of loquat under the stress of low temperature， among which the treatment with 175 mg·L-1 ALA had the most significant effect.

Key words： 5aminolevulinic acid; Loquat; Low temperature stress; AsA-GSH circulation

枇杷Eriobotrya japonica Lindl.是一種典型的亞熱帶常綠果樹，好濕潤、溫和的氣候條件。枇杷品種根據(jù)生態(tài)類型可分為耐寒性較強的溫帶型品種和耐寒性較弱的熱帶型品種，而低溫脅迫則是熱帶型枇杷品種生長的關(guān)鍵性因子。近些年來，我國南方山地枇杷產(chǎn)區(qū)都有出現(xiàn)不同程度的凍害，福建主要以早鐘6號枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.cv.Zaozhong No.6）受冷害最為嚴重[1]。探討枇杷抗凍性的調(diào)控機制對于減少因冷害造成的損失具有重要意義。5氨基乙酰丙酸（5aminolevulinic acid，簡稱ALA）是葉綠素等色素構(gòu)成的重要前體，也是一種存在于植物機體中的非蛋白氨基酸[2]。在低濃度條件下，ALA作為一種新的調(diào)節(jié)植物生長的激素類物質(zhì)，既可以提高植物的抗逆性，也可以促進植物的生長[3]。相關(guān)研究表明，施用ALA能明顯提高低溫脅迫下辣椒葉片中抗壞血酸（AsA）、還原型谷胱甘肽（GSH）等的含量，提高抗壞血酸過氧化物酶（APX）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）等的酶活性，降低植物葉片中活性氧的產(chǎn)生速率。因此，ALA能夠有效清除細胞內(nèi)的活性氧，進而減輕低溫脅迫的凍害[4]。趙寶龍等[5]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下，在葡萄葉面噴施ALA能夠提高葡萄葉片中AsA和GSH含量以及葉片中MDHAR、DHAR、GR和APX的活性，因而使AsA-GSH循環(huán)代謝正常有效地運行，增強了植物的耐鹽性，提高了植物清除活性氧的能力，緩解因鹽脅迫而造成的傷害。低溫條件下，枇杷極易受到凍害，目前已有相關(guān)學者研究了外源NO、GSH、SA、硝普鈉以及鈣調(diào)素拮抗劑TFP等對低溫脅迫下枇杷幼果AsA-GSH循環(huán)代謝的影響[6-9]，但是關(guān)于外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片AsAGSH循環(huán)的影響未見相關(guān)研究報道。本研究以早鐘6號枇杷品種為試驗材料，研究噴施不同濃度的外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片AsAGSH循環(huán)系統(tǒng)的影響，旨在為揭示其生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取沒有病蟲害的、沒有損傷的、長勢整齊一致的、生長正常的3年生早鐘6號枇杷容器苗為試材。樣品處理參照趙寶龍等[5]的方法稍做修改，處理前1 d將枇杷幼苗葉片沖洗干凈，A1、A2、A3處理分別采用100、150 、175 mg·L-1 ALA噴施葉片至濕潤為止，以噴施清水為對照（CK，0 mg·L-1ALA處理），2 d后于-3℃低溫下處理3 h，相對濕度70%，光照強度2000 Lx。每個處理3株，即為3次重復(fù)。采樣參照吳錦程等[10]的方法，選取枝條自上往下數(shù)第3～5片葉片（葉齡10～15 d）進行取樣，每個處理共取10片葉組成混合樣，并將樣品經(jīng)液氮速凍后置于-70℃超低溫冰箱中保存待測相關(guān)指標。

1.2 測定項目與方法

可溶性蛋白和H2O2含量的測定參照鄒琦等[11]的方法，以μmol·g-1表示H2O2含量，以mg·g-1表示蛋白質(zhì)含量。GSH和AsA含量測定參照陳建勛等[12]的方法，以μmol·g-1表示GSH和AsA的含量。DHAR和MDHAR活性測定參照宋松泉等[13]的方法，以μmol AsA·min-1·mg-1表示DHAR活性，以nmol NADH·min-1·mg-1表示MDHAR活性。GR和APX酶活性的測定參照陳建勛等[12]的方法，GR的1個酶活性單位用1 min內(nèi)OD340 nm變化0.01來定義，以室溫下1 min氧化1 μmol AsA的酶量作為一個酶活性單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗各項指標測定均為3次重復(fù)試驗，取平均值。試驗數(shù)據(jù)采用SSPS軟件和Microsoft Excel進行處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片H2O2含量的影響

植物細胞在低溫脅迫等逆境下會發(fā)生活性氧的積累，并使細胞質(zhì)膜過氧化加劇受損，從而使細胞受到凍害。由圖1可知，在-3℃低溫脅迫下，不同濃度外源ALA處理的枇杷葉片中H2O2含量均低于清水對照（CK），且差異達顯著水平（P<0.05）。175 mg·L-1處理與100、150 mg·L-1處理之間H2O2含量差異達顯著水平（P<0.05）。在低溫逆境下，不同濃度外源ALA處理的枇杷葉片H2O2含量表現(xiàn)為100 mg·L-1>150 mg·L-1 >175 mg·L-1，表明外源ALA處理能夠減少低溫逆境下枇杷葉片中H2O2含量的積累，隨著濃度的增加，枇杷葉片H2O2含量均呈下降趨勢。

2.2 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片AsA含量的影響

AsA能夠通過氧化還原反應(yīng)來清除H2O2，是植物細胞內(nèi)重要的抗氧化劑。由圖2可知，在-3℃低溫脅迫下，不同濃度外源ALA處理的枇杷葉片中AsA含量均高于清水對照（CK），且差異均達顯著或極顯著水平。175 mg·L-1 ALA 處理的枇杷葉片AsA含量上升最為明顯，與清水對照（CK）差異達極顯著水平（P<0.01）。在低溫逆境下，隨著外源ALA處理濃度的增加，枇杷葉片中AsA含量均呈上升趨勢。說明外源ALA能夠增加低溫脅迫下枇杷葉片AsA含量。

2.3 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片GSH含量的影響

GSH也是植物細胞內(nèi)重要的過氧化物清除劑之一。由圖3可知，在-3℃低溫脅迫下，枇杷幼苗葉片中GSH含量均隨著外源ALA濃度的增加而呈上升趨勢，大小變化表現(xiàn)為175 mg·L-1 >150 mg·L-1>100 mg·L-1，ALA處理的枇杷幼苗葉片中GSH含量均高于清水對照（CK），且差異均達顯著或極顯著水平。由此說明，外源ALA處理能夠提高低溫逆境下枇杷幼苗葉片中GSH含量，增加GSH的積累;并且隨著ALA濃度的增加，枇杷葉片中GSH含量均上升。

2.4 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片DHAR活性的影響

DHAR在維持植物細胞內(nèi)抗壞血酸的水平起著重要的作用。由圖4可見，在-3℃低溫脅迫下，隨著外源ALA濃度的增加，枇杷幼苗葉片中DHAR活性增加。外源ALA處理的枇杷幼苗葉片的DHAR活性均大于清水對照（CK），且差異達顯著或極顯著水平。150 mg·L-1處理與100 mg·L-1處理差異達顯著水平（P<0.05），175 mg·L-1處理與100 、150mg·L-1 處理差異達極顯著水平（P<0.01）?？梢?，不同濃度外源ALA處理對枇杷幼苗葉片DHAR活性有不同的影響，由此可以得出，外源ALA處理可以有效提高低溫脅迫下枇杷幼苗葉片DHAR活性。

2.5 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片MDHAR活性的影響

從圖5可知，在-3℃低溫脅迫下，枇杷幼苗葉片經(jīng)外源AsA各濃度的處理后，MDHAR的活性有提高，且均高于清水對照組（CK），其中100 mg·L-1處理的枇杷葉片MDHAR活性與清水對照差異不顯著（P>0.05），但150 mg·L-1 、175 mg·L-1 ALA處理的MDHAR活性與清水對照及100 mg·L-1 ALA處理差異達極顯著水平（P<0.01）。表明外源ALA處理對枇杷幼苗葉片MDHAR活性有一定的影響。在低溫脅迫下，不同濃度外源ALA處理的枇杷葉片MDHAR活性表現(xiàn)為175 mg·L-1>150 mg·L-1>100 mg·L-1。說明外源ALA的處理可以增加MDHAR活性。

2.6 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片APX活性的影響

從圖6可知，在-3 ℃低溫脅迫下，不同濃度外源ALA處理對枇杷幼苗葉片APX活性有不同的影響，但趨勢都高于清水對照組（CK）。并且隨著外源ALA濃度的增加，枇杷葉片APX活性也得到提高，差異性達顯著水平（P<0.05）。其中175 mg·L-1 ALA處理的枇杷葉片APX活性增加最為明顯，與清水對照（CK）處理相比差異達極顯著水平（P<0.01）。由此可說明，枇杷幼苗葉片在-3℃低溫脅迫下，葉片噴施一定濃度的外源ALA，可以顯著提高枇杷葉片中APX活性。

2.7 外源ALA對低溫脅迫下枇杷幼苗葉片GR活性的影響

植物細胞中GSH庫的水平與GR活性有關(guān)，GR能夠?qū)SSG還原為GSH，對維持AsA-GSH循環(huán)具有重要的作用，而且它的活性也是H2O2清除能力的標志。從圖7可知，在-3℃低溫脅迫下，外源ALA處理的枇杷幼苗葉片GR活性均提高，表現(xiàn)為175 mg·L-1>150 mg·L-1>100 mg·L-1 ，且與清水對照（CK）處理差異達顯著水平（P<0.05）。但經(jīng)外源ALA各處理之間GR活性差異均不顯著（P>0.05）。由此可以說明，外源ALA能夠提高低溫脅迫下枇杷葉片GR活性，促進其清除H2O2的能力。

2.8 外源ALA對低溫脅迫下枇杷葉片形態(tài)變化的影響

在-3℃低溫脅迫下，不同濃度外源ALA處理枇杷幼苗葉片的形態(tài)特征與清水對照（CK）存在差異。由圖8～9可知，在低溫脅迫處理后的第1 d，清水對照處理的枇杷幼苗葉片形態(tài)所表現(xiàn)出的凍害程度較重，呈現(xiàn)葉片卷曲，葉色褐變，而外源ALA處理的枇杷幼苗形態(tài)所表現(xiàn)出的凍害程度較清水對照（CK）處理輕，呈現(xiàn)葉片出現(xiàn)較少的卷曲，葉色褐變程度較輕，且隨著外源ALA濃度的增加，枇杷幼苗葉片形態(tài)所表現(xiàn)出的凍害程度趨于減輕。由圖8～9可見，在低溫脅迫處理后的第7 d，清水處理的枇杷幼苗葉片變化更為明顯，部分枇杷幼苗已枯萎，100 mg·L-1ALA處理的枇杷幼苗葉片枯萎程度較清水對照（CK）輕，而150 mg·L-1和175 mg·L-1ALA處理的枇杷幼苗葉片枯萎程度最輕。不同處理幼苗凍害的形態(tài)變化與對應(yīng)凍害的相關(guān)生理指標變化相吻合。

3 討論

植物在逆境條件下會發(fā)生過氧化氫的積累并且能夠氧化細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等，使細胞受到傷害，進而加快細胞的衰老和解體[14]。AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除細胞活性氧的重要途徑之一，能夠提高植物的抗逆性[15]。AsA-GSH循環(huán)中兩種重要的抗氧化劑是AsA和GSH，且GR、MDHAR、DHAR、APX等也是AsA-GSH循環(huán)體系中重要的組成酶。在AsA-GSH循環(huán)體系中，在APX的催化下，抗壞血酸能與過氧化氫反應(yīng)，使其接受以還原型谷胱甘肽為中介的NADPH電子供體最終還原為水，進而達到H2O2的清除。而ASA則通過MDHAR的作用再生成，GSH則在GR的作用下再生成[16-17]。AsA能有效清除活性氧減輕植物細胞的氧化受損，有研究表明，在低溫脅迫下，對辣椒葉片噴施一定濃度的ALA能夠提高辣椒葉片中AsA含量，降低活性氧的產(chǎn)生速率，進而緩解低溫逆境對辣椒的傷害[4]。本研究中不同濃度外源ALA處理能提高枇杷葉片AsA含量進而減少H2O2含量，減輕低溫脅迫對枇杷的傷害。GSH能夠通過參與AsA-GSH循環(huán)來清除H2O2，或是直接清除H2O2。GSH還具有加快AsA再生的作用。相關(guān)研究表明，鹽脅迫下對黃瓜幼苗噴施外源

ALA能提高黃瓜幼苗中GSH含量，增強其抗鹽性[3]。本研究結(jié)果表明，外源ALA處理能夠提高低溫脅迫下枇杷幼苗葉片中GSH含量，清除逆境下積累的H2O2，進而減輕細胞的損傷。

在低溫脅迫下，AsA在APX作用下清除H2O2，而AsA被氧化形成DHA和MDHA，MDHA和DHA在MDAR和DHAR作用下再生成AsA，因而MDHAR和DHAR的活性也得到相應(yīng)的提高[5]。有研究表明，在低溫脅迫下，草莓葉片中APX活性的增加提高了植物的抗性[18]。本試驗結(jié)果表明，在枇杷葉面噴施外源ALA能夠進一步提高低溫脅迫下枇杷葉片中APX、MDHAR、DHAR活性，其結(jié)果與外源ALA緩解黃瓜幼苗鹽脅迫的效果及機理研究的結(jié)果一致[19]。GR是植物細胞中清除活性氧的重要組分之一，其活性能直接影響還原型谷胱甘肽庫的水平。有研究發(fā)現(xiàn)在玉米幼苗表面噴施一定濃度的外源ALA能夠有效提高GR活性，進而提高玉米幼苗的抗冷性[20]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在枇杷葉面噴施一定濃度的外源ALA能有效地提高低溫脅迫下枇杷葉片中GR活性，從而減輕低溫脅迫對枇杷的凍害。4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在低溫脅迫下枇杷幼苗葉面噴施外源5氨基乙酰丙酸（ALA）能夠進一步提高枇杷幼苗葉片中AsA和GSH的含量以及DHAR、MDHAR、GR和APX的活性，降低H2O2的含量，從而促使AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的正常有效運行，提高枇杷幼苗清除H2O2的能力，使枇杷幼苗葉片的形態(tài)變化較小，進而能有效緩解因低溫脅迫而造成枇杷幼苗的氧化傷害，增強植物的抗冷性。

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（責任編輯：林玲娜）