CRISPR/Cas9技術(shù)在豬常見病毒性疾病防控中的應(yīng)用

魏 楠，谷 峰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)與Cas9蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)是第三代基因組編輯技術(shù)。基因組編輯技術(shù)基于基因靶向修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因定點(diǎn)敲除和外源基因定點(diǎn)整合，已經(jīng)被用于多種模式動(dòng)物的品種改良和疾病防治，基因組編輯技術(shù)先后經(jīng)歷了大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZNF)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)等技術(shù)的發(fā)展。CRISPR/Cas9技術(shù)作為目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯工具，為預(yù)防和控制病毒感染提供了新的思路，例如可用于全基因組篩選病毒毒力基因、通過靶向病毒基因缺失或突變生產(chǎn)減毒疫苗、研發(fā)動(dòng)物抗病育種等。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)在豬病毒性疾病防控中的應(yīng)用

豬臨床上的病毒性疾病主要包括非洲豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、偽狂犬病、豬流行性腹瀉和豬流感等，這些疾病都具有較高的發(fā)病率和病死率等特點(diǎn)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成極大的威脅。豬作為一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和大型模式動(dòng)物，對(duì)其進(jìn)行基因組編輯不僅能提高生產(chǎn)性能、加速新品種的培育，還為相關(guān)病毒性疾病的防治提供了新的思路。

1.1 非洲豬瘟非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬巨噬細(xì)胞是ASFV的主要天然宿主細(xì)胞[1]，盡管被敲除的巨噬細(xì)胞表面蛋白CD163也被認(rèn)為是一種潛在的ASFV受體，然而CD163基因編輯豬卻不能抵抗ASFV的感染[2]。傳統(tǒng)的ASFV疫苗研究存在不同程度的局限性，通過建立ASFV CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)平臺(tái)，將為ASFV基因功能研究提供便捷的工具，加快疫苗研究進(jìn)程。目前，CRISPR/Cas9已經(jīng)被成功用于ASFV的基因編輯研究中。BORCA等[3]首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)描述了基于高毒性ASFV-G基因缺失重組病毒的研究，以豬巨噬細(xì)胞培育強(qiáng)毒力毒株Georgia07，用CRISPR/Cas9從毒株基因組中敲除非必需基因8-DR，以紅色熒光蛋白(RFP)基因代替，獲得了重組效率高且易于純化的重組病毒。HüBNER等[4]首次證明，在表達(dá)相關(guān)基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的細(xì)胞中，ASFV的復(fù)制可以被抑制，用CRISPR/Cas9靶向ASFV磷酸化蛋白p30基因(CP204L)71～78密碼子的gRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染修飾野豬肺細(xì)胞系(WSL)，結(jié)果顯示ASFV在WSL細(xì)胞中產(chǎn)量降低，表明CRISPR/Cas9介導(dǎo)的ASFV p30基因靶向是一種有效的抗ASFV感染的策略。

1.2 豬繁殖與呼吸綜合征豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又稱為藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的，是高度傳染的病毒性疾病，可導(dǎo)致豬的晚期流產(chǎn)、死胎和呼吸系統(tǒng)疾病，對(duì)全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。相關(guān)研究表明,CD163是調(diào)控PRRSV感染初始階段的關(guān)鍵因子[5]。2014年，美國密蘇里大學(xué)WHITWORTH等[6]使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向2個(gè)內(nèi)源基因(CD163和CD1D)來獲得轉(zhuǎn)基因豬。該團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究表明,CD163基因編輯豬對(duì) PRRSV NVSL 97-7895 病毒株有抵抗力，未表現(xiàn)出任何與 PRRS 相關(guān)的臨床癥狀，且生長健康[7]。BURKARD等[8]獲得了CD163外顯子7敲除的豬，該豬表達(dá)缺失SRCR5的CD163蛋白，研究發(fā)現(xiàn)缺失SRCR5不影響豬巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能，而且該豬可抵抗Ⅰ型 PRRSV的1、2、3 亞型和Ⅱ型 PRRSV 的感染。WELLS等[9]將人類CD163 受體的SRCR8 結(jié)構(gòu)域同源物替代了豬SRCR5 結(jié)構(gòu)域，獲得了對(duì)Ⅰ型 PRRSV 具有抵抗性，但對(duì)Ⅱ型PRRSV仍然敏感的豬?？缒ぬ堑鞍?4-1BB)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，是T細(xì)胞協(xié)同刺激分子。HUANG等[10]通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，獲得了高表達(dá)4-1BB的豬，該豬對(duì)PRRSV疫苗的免疫反應(yīng)結(jié)果表明，高水平4-1BB的表達(dá)能夠促進(jìn)Th1分化和增強(qiáng)對(duì)PRRSV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，該研究提供了一種新的策略來提高疫苗的免疫效力。

在高致病性PRRS的研究中，YANG等[11]采用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得CD163基因敲除豬，該豬能完全抵抗HP-PRRSV TP毒株感染，另外，有研究者用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得CD163外顯子7敲除豬[12]，或者將豬CD163的外顯子7替換為人類的相應(yīng)外顯子(hCD163L1)[13]，所獲得的基因編輯豬可抵抗HP-PRRSV相關(guān)毒株的感染，如JXA1、JXwn06等，且對(duì)CD163的生物學(xué)功能無不良影響。

1.3 豬偽狂犬病豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的豬急性傳染病，主要引起仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉嘔吐，病死率高達(dá)100%，妊娠母豬流產(chǎn)、死胎等，嚴(yán)重危害全球豬養(yǎng)殖業(yè)。PRV是α皰疹病毒亞科的成員，基因組為線狀雙鏈DNA分子，約150 kb，由于PRV基因組很大，傳統(tǒng)基因操作方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而CRISPR/Cas9技術(shù)不失為一種快捷可行的方法。

1.3.1PRV疫苗生產(chǎn) 2011年，PRV毒株發(fā)生變異，傳統(tǒng)的Bartha-K61疫苗未能提供對(duì)變異株的完全保護(hù)，對(duì)有效的疫苗開發(fā)提出了迫切的需求。XU等[14]首次使用CRISPR/Cas9技術(shù)用于PRV 基因組編輯，將純化的PRV 基因組與Cas9 sgRNA 共轉(zhuǎn)染到PK-15細(xì)胞中，獲得高達(dá)100%病毒基因破壞率。LIANG等[15]提出了一種基于CRISPR/Cas9和Cre/Lox系統(tǒng)的快速疫苗開發(fā)策略，使用CRISPR/Cas9技術(shù)，PRV毒力基因GE和TK分別被標(biāo)記基因GFP和mCherry取代，隨后用Cre/Lox系統(tǒng)切除標(biāo)記基因，成功獲得了第1個(gè)基于CRISPR/Cas9技術(shù)的PRV候選疫苗。TANG等[16]獲得了一種表達(dá)螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的重組PRV 毒株，作為PRV 特異性的sgRNA 篩選和抗病毒化合物快速評(píng)估的報(bào)告病毒。最后，利用該報(bào)告病毒，成功開發(fā)了US2、US3和US9滅活的PRV 毒株，并證明氯喹抑制PRV HeN1毒株復(fù)制。TANG 等[17]設(shè)計(jì)了一種使用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯PRV 基因組的方法，以快速減毒PRV,開發(fā)了三重gE/gI/TK基因滅活的HeN1 PRV 毒株，該方法也適用于其他的難以操作的大型DNA 病毒。新出現(xiàn)的PRV 變異株JS-2012的糖蛋白B(gB)基因與疫苗株Bartha -K61相比有多個(gè)變異，YU等[18]用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了以Bartha-K61基因組為骨架，Bartha-K61 gB基因被替換為JS-2012 gB基因的重組病毒BJB，用滅活的 BJB 對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種，攻毒結(jié)果顯示BJB 的保護(hù)率是80%， 該研究表明了gB基因在保護(hù)性免疫中的重要性。SUI等[19]通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了豬核糖核酸酶L(sRNase L)基因敲除的PK-15細(xì)胞系，研究結(jié)果顯示與親代PK-15細(xì)胞系相比，病毒在該細(xì)胞系中產(chǎn)量更高，該細(xì)胞系可作為研究sRNase L 功能和優(yōu)化PRV 疫苗生產(chǎn)的工具。

1.3.2PRV 毒力基因研究 TANG等[20]使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了10個(gè)潛在的PRV 毒力基因，并在小鼠模型中評(píng)估了各突變體的致病性，結(jié)果顯示胸苷激酶(TK)和糖蛋白M(gM)基因敲除突變體的毒力顯著降低，顯示TK和gM是PRV的關(guān)鍵毒力基因。而YE等[21]采用CRISPR/Cas9技術(shù)分別獲得UL24和TK 基因缺失PRV 病毒，其研究顯示與TK基因相比，UL24是一種次要的PRV 毒力基因。

1.3.3PRV 逃避CRISPR/Cas9抑制及其機(jī)制研究 病毒從CRISPR/Cas9介導(dǎo)的抑制中逃逸可能會(huì)限制該技術(shù)在病毒防制中的應(yīng)用，而相關(guān)研究表明PRV可以逃避CRISPR/Cas9介導(dǎo)的抑制。PENG等[22]使用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了敲除PRV UL30基因的PX459細(xì)胞系，可顯著抑制PRV 的復(fù)制，然而隨著細(xì)胞傳代的增加，病毒滴度也逐漸增加，發(fā)現(xiàn)了PRV 可以逃脫CRISPR/Cas9系統(tǒng)的抑制。REN等[23]進(jìn)一步研究闡明了經(jīng)過編輯的PX459細(xì)胞傳代對(duì)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PRV復(fù)制沒有影響。TANG等[24]研究證實(shí)了單個(gè)sgRNAs 靶向會(huì)產(chǎn)生PRV 逃逸，而多個(gè)sgRNAs 同時(shí)靶向完全抑制PRV 復(fù)制，強(qiáng)調(diào)了多靶向的重要性。

1.3.4在PRV其他方面的應(yīng)用 GUO等[25]使用CRISPR/Cas9技術(shù)大幅度提高同源重組的效率，建立了一種快速的插入大基因組細(xì)菌人工染色體BACs 的方法，重組效率高達(dá)86%。α皰疹病毒的病毒宿主關(guān)閉蛋白基因UL41被認(rèn)為可誘導(dǎo)降解宿主mRNAs 并關(guān)閉宿主蛋白質(zhì)合成，在PRV 的宿主關(guān)閉機(jī)制研究中，YE等[26]利用CRISPR/Cas9結(jié)合Gibson 組件獲得了UL41基因敲除的PRV,結(jié)果顯示該病毒不能顯著降低感染早期宿主基因的表達(dá)量，表明PRV 的其他病毒因素也可能參與宿主關(guān)閉。

1.4 豬病毒性腹瀉豬病毒性腹瀉是一種急性的豬消化道傳染疾病，仔豬最易感且病死率高，臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水，引起該病的主要病原包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和輪狀病毒(rotavirus,RV)，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1.4.1TGEV TGEV是α屬冠狀病毒，是一種包膜、單股正鏈的RNA病毒。氨基肽酶N(APN)被認(rèn)為是多種α冠狀病毒的受體，包括TGEV[27]、PDCoV和人冠狀病毒229E(HCoV-229E)。冠狀病毒spike蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域也被認(rèn)為是導(dǎo)致該病不同臨床癥狀的原因。WANG等[28]用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)TGEV spike基因N端域224個(gè)氨基酸缺失的重組病毒，其結(jié)果表明，spike基因N端域的缺失對(duì)TGEV的毒力影響較小，spike蛋白的N端域不是TGEV的毒力決定因子。SHEN等[29]研究則表明α屬冠狀病毒的nsp1蛋白是TGEV重要的毒力決定因子，使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建重組TGEV，改變了nsp1的特定序列，發(fā)現(xiàn)該突變不影響病毒的復(fù)制，但降低了TGEV的致病性，還發(fā)現(xiàn)α屬冠狀病毒nsp1的特定序列(氨基酸91～95)是抑制宿主基因表達(dá)的保守區(qū)域，該結(jié)果為開發(fā)基于修飾nsp1的減毒疫苗提供了參考。

1.4.2PEDV PEDV是α屬冠狀病毒，盡管APN被認(rèn)為是多種α屬冠狀病毒的受體，但相關(guān)研究證明APN基因編輯豬不能抵抗PEDV的感染，APN對(duì)PEDV的入侵感染不是必需的[30-32]。為了探究淋巴毒素β受體(LTβR)在PEDV感染中的作用，ALTAWATY等[33]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了LTβR敲除IPEC-J2細(xì)胞，LTβR的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞S期積累，增加了細(xì)胞對(duì)PEDV感染的易感性，表明LTβR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)在維持IPEC-J2細(xì)胞增殖和保護(hù)IPEC-J2細(xì)胞免受PEDV感染中起關(guān)鍵作用，但其調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。TU等[34]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了胞苷磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)基因敲除的仔豬，使N-羥乙基神經(jīng)氨酸(NGNA)無表達(dá)，攻毒結(jié)果顯示該豬不能對(duì)PEDV免疫，但可以減輕PEDV感染的嚴(yán)重性并延緩其發(fā)生。

1.4.3RV RV是重要的人畜共患病原之一，是引起嬰幼兒和多種幼齡動(dòng)物急性腹瀉的主要病原體之一，其基因組由11段雙鏈RNA組成，編碼6種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP5/6)，在9個(gè)RV基因組(A～I(xiàn))中，RVA、RVB、RVC和RVH與仔豬腹瀉有關(guān)。

研究者用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯用以生產(chǎn)RV疫苗的Vero細(xì)胞[35-37]，編輯了細(xì)胞的NUE2、NAT9、COQ9、EMX2等基因，使RV產(chǎn)量顯著增加，改進(jìn)了RV在Vero細(xì)胞系產(chǎn)量較低的問題。LI等[38]在研究RV感染的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，在RV感染期間一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白drebrin(DBN1)與VP4共沉淀和共定位，通過siRNA沉默、CRISPR敲除或化學(xué)抑制阻斷DBN1功能，顯著提高了宿主細(xì)胞對(duì)RV的易感性，表明DBN1基因有限制RV進(jìn)入宿主細(xì)胞的能力。在翻譯啟動(dòng)因素調(diào)節(jié)RV感染的機(jī)制研究中，CHEN等[39]分析了真核翻譯起始因子4F(eIF4F)復(fù)合物在RV感染中的作用，使用CRISPR/Cas9技術(shù)分別對(duì)eIF4F復(fù)合物的組分進(jìn)行敲除，結(jié)果eIF4F的3個(gè)組分(包括eIF4A、eIF4E和eIF4G)功能喪失，均顯著提升了RV基因組RNA和病毒蛋白VP4的表達(dá)水平，還證實(shí)eIF4F復(fù)合物是通過調(diào)節(jié)抗病毒蛋白IRF1和IRF7來抵抗RV感染。DING等[40]用CRISPR/Cas9全基因組篩選促進(jìn)RV感染的宿主因子，研究表明Cohesin 蛋白的核心亞基STAG2會(huì)促進(jìn)RV感染，STAG2的缺失會(huì)激活cGAS-STING-IRF3信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答，并廣泛限制病毒(包括RV)感染，STAG2突變在多種腫瘤類型中被檢測到，該研究結(jié)果可為相關(guān)腫瘤的治療提供參考。

1.5 豬瘟豬瘟俗稱“爛腸瘟”，又稱古典豬瘟，是一種傳染性極強(qiáng)的病毒性疾病，由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起，CSFV為單股正鏈RNA病毒，病毒基因組編碼一種多蛋白前體，該前體進(jìn)一步被蛋白酶水解為4種結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[41]。NS4B蛋白對(duì)病毒RNA復(fù)制至關(guān)重要，且與CSFV毒力有關(guān)[42]，有研究表明RING E3泛素連接酶通過各種機(jī)制抑制病毒復(fù)制[43]。豬RNF114蛋白(pRNF114)是RING E3泛素連接酶的成員，ZHANG等[44]使用CRISPR/Cas9技術(shù)在PK-15細(xì)胞中敲除RNF114，促進(jìn)了CSFV的復(fù)制，研究結(jié)果表明pRNF114是一種抗CSFV因子，其抗CSFV作用取決于其RING E3泛素連接酶的活性，pRNF114結(jié)合NS4B蛋白，并催化NS4B蛋白K27連接的多聚泛素化，引起NS4B蛋白降解從而抑制CSFV的復(fù)制。XIE等[45]篩選了抗病毒小發(fā)夾RNA(shRNAs)，通過CRISPR/Cas9技術(shù)將其插入豬Rosa26基因座，并成功獲得了抗CSFV感染的基因編輯豬，其抗病性可以穩(wěn)定地傳遞到F1代。RSAD2基因具有針對(duì)多種DNA和RNA病毒的抗病毒活性，XIE等[46]用CRISPR/Cas9技術(shù)將豬RSAD2基因(pRSAD2)插入豬Rosa26基因座，并成功獲得可以抵抗CSFV感染的豬。

1.6 豬圓環(huán)病毒病豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)的血清型有PCV1、PCV2和PCV3。PCV1無致病性，PCV2、PCV3為致病性的病毒，PCV2與一系列疾病的發(fā)生有關(guān)，這些疾病被稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，如斷奶后多系統(tǒng)消瘦綜合征、豬皮炎腎病綜合征等。有研究表明，PCV2感染通過上調(diào)P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，XU等[47]使用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了p53基因敲除的PK-15細(xì)胞系，進(jìn)一步探究p53 在PCV2感染中的作用，結(jié)果表明在PK-15細(xì)胞中，PCV2通過p53調(diào)控p21、Cyclin E的上調(diào)和Cyclin A、CDK 2蛋白的下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞S期積累，從而維持其自身復(fù)制。SYNGR2基因是一組主要在神經(jīng)元細(xì)胞突觸囊泡膜中表達(dá)的基因，WALKER等[48]研究結(jié)果顯示PCV2b(UNL2014001)毒株在SYNGR2基因敲除的PK-15細(xì)胞中病毒產(chǎn)量降低，為SYNGR2參與促進(jìn)PCV2感染提供了證據(jù)。

1.7 豬流感豬流感(swine influenza,SI)是由甲型流感病毒(IAV)引起的豬急性呼吸道傳染病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成危害，對(duì)人類健康也具有潛在威脅。目前,豬群中流行的IAV以H1N1、H1N2和H3N2亞型為主，這里簡要回顧了CRISPR/Cas9技術(shù)在IAV相關(guān)研究中的應(yīng)用。

1.7.1IAV與宿主相互作用機(jī)制研究 CRISPR/Cas9技術(shù)可應(yīng)用于探究IAV與宿主之間相互作用機(jī)制，為IAV的防控提供線索。IAV基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制發(fā)生在感染細(xì)胞的核內(nèi)，宿主對(duì)抗IAV感染的有效途徑是靶向核導(dǎo)入。劉麗素等[49]用CRISPR/Cas9技術(shù)在人肺癌細(xì)胞A549中敲除核輸入蛋白 importin α7，研究importin α7 對(duì)不同來源和亞型的流感病毒生長的影響，其結(jié)果表明不同亞型流感病毒結(jié)合 importin α的特異性不同，流感病毒可能進(jìn)化出不同機(jī)制來利用importin α亞型進(jìn)行核輸入。LUO等[50]研究顯示用CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞中敲除磷脂爬行酶1(PLSCR1)的表達(dá)促進(jìn)了多種亞型IAV復(fù)制，證明了PLSCR1是對(duì)抗IAV感染的重要因素，其機(jī)制是PLSCR1與核蛋白(NP)和importin α家族成員形成三聚體復(fù)合物，該復(fù)合物抑制了importin β與importin α形成功能性核導(dǎo)入受體復(fù)合物，損害NP的核導(dǎo)入從而抑制IAV復(fù)制，PLSCR1不影響NP的磷酸化狀態(tài)，也不激活I(lǐng)FN途徑。IAV在感染過程中利用多種宿主蛋白，SAMMAIBASHI等[51]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了真核翻譯延長因子1γ(eEF1G)敲除A549細(xì)胞系，在該細(xì)胞中，A/WSN/33(H1N1)病毒的復(fù)制和蛋白表達(dá)受到顯著抑制，但病毒基因表達(dá)水平未降低，表明eEF1G在病毒蛋白的轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，還驗(yàn)證了WSN病毒的PB2和PA蛋白受eEF1G的調(diào)控，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。許多病毒在進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)下調(diào)p53從而減弱宿主的抗病毒反應(yīng)，但I(xiàn)AV感染會(huì)上調(diào)p53。WANG等[52]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得p53敲除的A549細(xì)胞，p53的缺失可引起IAV產(chǎn)量降低，其研究表明激活p53途徑是IAV感染過程中的重要步驟，通過上調(diào)p53，抑制干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITMs)的表達(dá)從而維持IAV感染。

1.7.2IAV疫苗開發(fā)和抗病毒策略研究 miR-21在流感病毒易感宿主中普遍表達(dá)，WARING等[53]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了miR-21敲除的MDCK細(xì)胞系，成功開發(fā)了一種新的IAV疫苗生產(chǎn)方法。有研究表明，流感病毒感染依賴于細(xì)胞脂質(zhì)，包括鞘脂、鞘磷脂和鞘氨醇。DREWS等[54]用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了敲除葡萄糖神經(jīng)酰胺酶(GBA)基因的HEK293和A549細(xì)胞系，觀察到PR8(H1N1)綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告病毒在2種細(xì)胞系中的產(chǎn)量降低，結(jié)果表明病毒產(chǎn)量降低與IAV的運(yùn)輸受損有關(guān)，證明了GBA對(duì)于病毒以及細(xì)胞物質(zhì)的內(nèi)吞運(yùn)輸至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種新的基因調(diào)控機(jī)制，關(guān)于lncRNA與流感病毒感染期間基因表達(dá)調(diào)控和抗病毒活性有關(guān)的研究較少。MORE等[55]鑒定了涉及IAV復(fù)制的lncRNA，證明了PSMB8反義RNA 1(PSMB8-AS1)是一種促進(jìn)IAV復(fù)制的lncRNA，PSMB8-AS1可能是開發(fā)抗IAV治療新的宿主因子靶點(diǎn)。SANYAL等[56]用CRISPR/Cas9技術(shù)參與編輯，探究NF-κB在IAV感染中的作用，結(jié)果表明IAV的基因型影響NF-κB是否顯示其抗病毒功能。

2 結(jié)束語及應(yīng)用前景

豬作為一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型，其選育和疾病防控越來越受到人們重視，尤其是近年非洲豬瘟疾病的流行對(duì)我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。新型基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9在豬相關(guān)領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，比如在抗病育種、疫苗生產(chǎn)、異種器官移植、疾病模型構(gòu)建、藥物靶點(diǎn)挖掘和疫病防制等方面。CRISPR/Cas9技術(shù)在豬病毒性疾病防控領(lǐng)域具有較高的科研價(jià)值和臨床治療意義，合理地應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，可探究病毒基因的功能、篩選毒力基因，探究病毒感染過程中關(guān)鍵的宿主因子和病毒因子，用于疫苗生產(chǎn)、研發(fā)抗病毒藥物和抗病毒分子育種等，可為生物醫(yī)學(xué)和豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)，應(yīng)用前景極為廣闊。