吳茱萸堿抗消化系統(tǒng)腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展

范春嬌，黃 鵬，黃貴華，邱 華，張曉梅

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023）

吳茱萸辛、苦、熱，主入肝胃脾經(jīng)，為消化系統(tǒng)常用中藥，具有散肝寒、降胃逆、補(bǔ)脾虛的功效，臨床上常用于肝寒頭痛、胃逆嘔吐、臟寒吐瀉、五更瀉等。吳茱萸堿（evodiamine，EVO）是吳茱萸主要生物堿之一，其有多種生物學(xué)效應(yīng)，如緩解慢性疼痛［1］、分泌兒茶酚胺［2］、抗炎、抗肥胖［3］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［4］、保護(hù)心血管［5］等作用。有研究報(bào)道其通過抑制炎癥反應(yīng)和維持線粒體抗氧化功能來減輕化療藥引起的神經(jīng)病理性疼痛［6］；通過激活內(nèi)源性凋亡通路選擇性抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［7］；通過抑制脂肪細(xì)胞中mTOR-S6K信號(hào)和IRS1絲氨酸磷酸化實(shí)現(xiàn)降低體重，控制血糖的作用［8］；通過Rho/NF-κB途徑改善抗氧化和抗炎狀態(tài)保護(hù)胃黏膜，治療胃潰瘍［9］；通過調(diào)節(jié)nNOS和抑制AMPA受體GluA 1緩解偏頭痛［10］；通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1/Smad途徑，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞到間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而預(yù)防心肌纖維化［11］等。此外，EVO還可以通過多種獨(dú)特的分子機(jī)制，抑制腫瘤血管的生成［12］、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到抗腫瘤的作用，其抗癌活性可能與Wnt/β-catenin、mTOR、NF-κB［13］、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）［14］和/或p53/p21/Rb等信號(hào)通路［15］有關(guān)。因此，EVO通過何種途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用是近年的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)吳茱萸堿抗消化系統(tǒng)腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述，為EVO在日后臨床應(yīng)用和深入研究提供依據(jù)。

1 腫瘤的發(fā)生發(fā)展

對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展，醫(yī)學(xué)界有了較統(tǒng)一且深入的認(rèn)識(shí)，在細(xì)胞層面來看，可以總結(jié)為阻止細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞分化的信號(hào)異常、細(xì)胞獲得異常增殖能力；細(xì)胞凋亡過程異常、細(xì)胞具有侵襲浸潤(rùn)的能力及誘導(dǎo)異常血管生成等。而在這些事件中，主要涉及腫瘤干細(xì)胞（CSCs）異常分化增殖、信號(hào)通路及癌基因的異常激活，因此阻止這些事件的發(fā)生進(jìn)展成為了治療癌癥的關(guān)鍵。

2 EVO對(duì)信號(hào)通路的影響

EVO通過干預(yù)Wnt/β-catenin、mTOR、PI3K/Akt、Notch等信號(hào)通路傳導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展停緩，增加腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死比率、抑制腫瘤微血管的生成、阻止腫瘤細(xì)胞周圍侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，進(jìn)而達(dá)到控制腫瘤的目的。研究表明，盡管EVO對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，但其作用是選擇性的，有研究報(bào)道，EVO對(duì)人正常細(xì)胞無細(xì)胞毒作用［16］。

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路及Notch信號(hào)通路

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是維持細(xì)胞信號(hào)穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育所必需的，其在胚胎發(fā)育過程和維持干細(xì)胞自我更新和分化扮演重要角色，該通路的異?；钚员蛔C明可以促進(jìn)CSCs的自我更新，刺激血管生成以及維持高度耐藥，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤微環(huán)境、干性和化療耐藥有關(guān)，其抑制凋亡的功能可能促進(jìn)腫瘤的化療耐藥［17-19］。

Notch信號(hào)是干細(xì)胞不對(duì)稱分裂的調(diào)節(jié)因子，其與配體之間的相互作用啟動(dòng)了調(diào)節(jié)分化、增殖和凋亡的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在胰腺癌［20］、胃癌［21］、和結(jié)腸癌［22］等多種實(shí)體瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，Notch作為癌基因呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，其信號(hào)通路的異常激活可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。抑制一個(gè)子細(xì)胞中的Notch信號(hào)對(duì)于這些腫瘤的不對(duì)稱分裂為非干細(xì)胞狀態(tài)是至關(guān)重要的［23］。

EVO對(duì)Wnt/β-catenin及信號(hào)通路的作用：在Cai等［24］的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin與胃癌細(xì)胞球的形成能力相關(guān)，同時(shí)，經(jīng)EVO干預(yù)后的胃癌干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)基因，如β-catenin和c-myc、cyclinD1等基因表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，由此說明EVO能夠影響、調(diào)節(jié)胃癌干細(xì)胞的自我更新過程。Wen等［25］研究發(fā)現(xiàn)，EVO能夠降低胃癌干細(xì)胞（GCSCs）的球體形成能力及抑制胃癌細(xì)胞（GCC）的遷移特性，并且證實(shí)了EVO通過下調(diào)Wnt通路，顯著抑制GCSCs的增殖和自我更新，減少EMT因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致GCC的莖性下降。王強(qiáng)等［26］用EVO干預(yù)胰腺癌BxPC-3和PANC-1細(xì)胞株時(shí)，發(fā)現(xiàn)EVO能夠通過抑制細(xì)胞株的Wnt通路下游靶分子c-Myc和Cyclin D1的表達(dá)，刺激胰腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬過程增加，使細(xì)胞增殖過程受到阻滯。Wnt配體的表達(dá)情況直接影響Wnt/βcatenin信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在大腸癌中，王元惠等［27］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EVO干預(yù)的大腸癌細(xì)胞株HT 29中促進(jìn)血管生成的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及介導(dǎo)腫瘤向周圍組織浸潤(rùn)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）表達(dá)下降，同時(shí)，Wnt和β-catenin的mRNA含量下降，由此得出這樣的結(jié)論，EVO可能通過調(diào)節(jié)Wnt/βcatenin信號(hào)阻止了大腸癌惡性行為。在研究結(jié)腸癌過程中發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)中Notch1、HES5、HES1、Jagge及Wnt信號(hào)中LRP5和LEF1基因的表達(dá)均受抑制，說明了EVO能夠同時(shí)調(diào)節(jié)Notch及Wnt信號(hào)通路，從而達(dá)到抑制CSCs生物活性［28］。

2.2 mTOR信號(hào)通路

mTOR信號(hào)通路參與了蛋白的合成、能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、存活和遷移絲氨酸蛋白激酶，影響著腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。該通路的失控在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和血管生成等多種細(xì)胞功能的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)［29］，mTOR在胃癌中高度活化，其下游有2個(gè)非常重要的分子，真核細(xì)胞起始因子el F-4E結(jié)合蛋1（4E-BP1）和核糖體蛋白S6激酶（p70S6K），分別參與蛋白翻譯、合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和周期調(diào)節(jié)。

EVO作用于mTOR信號(hào)通路：在胃癌中，mTOR通路通過在腫瘤中增加mTOR復(fù)合物1（MTORC1）的磷酸化，降低P70S6K1-mTORC2的反饋活性導(dǎo)致線粒體過程、血管生成和核糖體生物生成不受控制和增加，進(jìn)而影響腫瘤蛋白質(zhì)合成過程、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和自噬［30］。劉鑫等［31］研究發(fā)現(xiàn)，EVO作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞后抑制mTOR、p70S6K和4EBP1mRNA的表達(dá)，在蛋白水平上抑制細(xì)胞mTOR總蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)，由此推測(cè)EVO可能通過抑制上游Akt，AMPK激酶活性影響mTOR及其磷酸化蛋白表達(dá)或是作用于mTOR及其磷酸化蛋白進(jìn)而抑制下游底物的表達(dá)。

2.3 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）通路

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子一員，最先發(fā)現(xiàn)具有控制骨形成的作用。在胃腸道中，BMP能通過調(diào)節(jié)間質(zhì)微環(huán)境，保護(hù)結(jié)腸間充質(zhì)的息肉起始和腸道分泌前體細(xì)胞的終末分化［32，33］，在胃腸道發(fā)育和病理過程中起關(guān)鍵作用。大多數(shù)BMP主要由間充質(zhì)產(chǎn)生，并通過旁分泌或自分泌途徑激活其信號(hào)通路。在結(jié)腸癌、肝癌中，BMP通路能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，其表達(dá)水平與腫瘤分期呈正相關(guān)。

EVO對(duì)P53、BMP9的作用：腫瘤抑制蛋白（p53）是一種能夠調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞周期、凋亡、DNA損傷修復(fù)、代謝、炎癥和免疫反應(yīng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的腫瘤抑制因子，在維持染色體及基因組穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用［34］。研究發(fā)現(xiàn)EVO可顯著上調(diào)HCT 116細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（BMP9）及缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，在HCT 116細(xì)胞中，EVO可增加p53的磷酸化，BMP9可使其磷酸化增強(qiáng)，而BMP9沉默可使其磷酸化水平降低。此外，EVO對(duì)p53的作用可被缺氧誘導(dǎo)因子-1α增強(qiáng)，而被缺氧誘導(dǎo)因子-1α沉默而減弱，其機(jī)制可能是通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)，部分提高P53的活性，從而介導(dǎo)BMP9的抗癌作用［35］。

2.4 JAK2/STAT 3信號(hào)通路

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT 3）是STAT家族中最常被被激活的成員，其能夠?qū)⑿畔鬟f到細(xì)胞核，介導(dǎo)著細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。在生理狀態(tài)下，JAK激酶能夠激活STAT參與細(xì)胞的增殖與分化、存活與凋亡及細(xì)胞免疫等過程［36］。在病理狀態(tài)下，異常的STAT 3信號(hào)通過激活MMP2、MMP9和Cten的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖以及遷移和侵襲，通過促進(jìn)EGF、VEGF、PVDF和HGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［37］。大量研究表明，JAK/STAT 3信號(hào)通路在血液惡性腫瘤及實(shí)體腫瘤（如肺癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等）中可通過VEGF促進(jìn)腫瘤血管形成，因此抑制JAK/STAT 3通路的激活能夠成為抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的一個(gè)靶點(diǎn)。

EVO對(duì)JAK2/STAT 3信號(hào)通路的作用：在結(jié)腸癌中，研究證明用EVO干預(yù)HCT-116細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮聚集、染色質(zhì)碎裂成塊等形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)，HCT-116細(xì)胞內(nèi)p-STAT 3的表達(dá)受到抑制，EVO可能是通過抑制JAK2/STAT 3信號(hào)通路的激活從而抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞活性［38］。

2.5 SIRT 1信號(hào)通路

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT 1）是一種在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)生存、衰老、凋亡及分化等過程中具有重要作用的組蛋白脫乙酰酶。SIRT 1在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其能夠促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移。近期研究發(fā)現(xiàn)，SIRT 1可能參與調(diào)節(jié)腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展過程，并在許多惡性腫瘤中檢測(cè)到其表達(dá)異常［39］。SIRT 1可能是判斷大腸癌預(yù)后不良的一種新的生物標(biāo)志物［40］。

EVO對(duì)SIRT 1、NF-κB的作用：NF-κB是一種在腫瘤發(fā)生中起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)細(xì)胞的癌變、轉(zhuǎn)移及生存具有調(diào)控作用。同時(shí)NF-κB還能調(diào)控多種基因，如細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和c-Myc、抗凋亡基因（如Survivin、Bcl-2和Bcl-XL）。研究表明，EVO能夠抑制NF-κB的誘導(dǎo)性和結(jié)構(gòu)性激活及NF-κB參與調(diào)節(jié)的基因表達(dá)，而這些強(qiáng)有效的抑制作用為EVO在抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)等過程提供了分子基礎(chǔ)［41］。相反的，李海星等［42］認(rèn)為EVO能激活NF-κB信號(hào)通路，在觀察EVO干預(yù)大腸癌HCT-116細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EVO作用后的HCT-116細(xì)胞，其NF-κB m RNA和蛋白的表達(dá)增加，而SIRT 1、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)出現(xiàn)抑制，從而說明了EVO通過抑制SIRT 1的表達(dá)，激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)MMP-9表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌的抑制。

2.6 Hippo-YAP信號(hào)通路

Hippo信號(hào)調(diào)控具有細(xì)胞增殖、存活、分化的作用，參與組織穩(wěn)態(tài)和腫瘤抑制等多種過程，其能夠通過抑制YAP和TAZ參與器官大小控制和腫瘤發(fā)生的抑癌途徑［43］。在Hippo-YAP通路中YAP的過度激活也導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

EVO對(duì)Hippo-YAP信號(hào)通路的作用：趙爽等［44］用EVO干預(yù)肝癌BEL-7402細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EVO能夠增加BEL-7402細(xì)胞凋亡比率，且BEL-7402的細(xì)胞周期停滯于G2/M期，同時(shí)MST 2和LATS1在BEL-7402細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，而YAP表達(dá)受到抑制，提示EVO可能通過激活Hippo信號(hào)通路抑制下游基因YAP的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌BEL-7402細(xì)胞的凋亡。

2.7 NOD1通路

NOD1參與維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和宿主對(duì)細(xì)菌和某些病毒的防御，其不僅能通過介導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑啟動(dòng)NF-κB依賴和MAPKB依賴的基因轉(zhuǎn)錄［45］，以調(diào)節(jié)宿主防御和組織穩(wěn)態(tài)、增強(qiáng)癌細(xì)胞的黏附、遷移和轉(zhuǎn)移，還能激活多個(gè)下游的炎癥信號(hào)通路及免疫信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，而對(duì)這些細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)病原體的清除是非常重要的［46，47］。

EVO對(duì)NOD1信號(hào)通路的作用：在肝癌細(xì)胞中NOD1的敲除顯著誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂期，而過表達(dá)的NOD1顯著誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期［48］。Guo等［49］發(fā)現(xiàn)EVO能夠通過上調(diào)Rp53和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、cyclinB1和cdc2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)肝癌Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞周期停滯于G2/M期。此外，EVO還降低了肝癌細(xì)胞中NOD1、p-p65、p-erk、pp38和p-jnk的表達(dá)水平，這說明了EVO可能通過抑制NOD1信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

2.8 EVO促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

細(xì)胞凋亡是以DNA片段化、核固縮和特異性蛋白質(zhì)降解為特征的，其發(fā)生是一種自主有序的生理過程，凋亡抵抗是腫瘤的一個(gè)標(biāo)志，是抗癌治療的重要障礙。細(xì)胞凋亡在組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用，并受促癌基因、抑癌基因、半胱氨酸天冬氨酸（caspase）蛋白酶、Survivin等調(diào)控。在促癌基因及抑癌基因中，Bax表達(dá)增多及Bcl-2抑制提示細(xì)胞凋亡的正向作用。而caspase蛋白酶作為細(xì)胞凋亡過程的中心執(zhí)行者，在當(dāng)中扮演著不可或缺的角色。Survivin是一種對(duì)凋亡產(chǎn)生抑制作用的蛋白，在細(xì)胞周期S期和G2/M期的有絲分裂中常有表達(dá)，并且顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，在癌細(xì)胞中，Survivin的表達(dá)是失控的［50］。調(diào)節(jié)上述基因的表達(dá)，對(duì)癌細(xì)胞的凋亡及增殖過程有積極作用。

Yang等［51］研 究 發(fā) 現(xiàn)，胃 癌SGC-7901細(xì) 胞 經(jīng)EVO干預(yù)后，癌基因Bcl-2/Bax比率顯著下降，并且對(duì)Bcl-2磷酸化，同時(shí)通過激活caspases提高caspase-3活性產(chǎn)生一氧化氮（NO）增加SGC-7901細(xì)胞凋亡比例。Shen等［52］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EVO處理的胃癌細(xì)胞中，Survivin mRNA水平呈劑量依賴性降低，caspase-3 mRNA水平升高，提示EVO通過抑制抗凋亡基因Survivin表達(dá)，增加促凋亡caspase-3 mRNA基因表達(dá)從而達(dá)到降低胃癌細(xì)胞增殖比率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。在結(jié)腸癌中，Zhang［53］發(fā)現(xiàn)EVO作用Lovo細(xì)胞后，cyclinA/Cdk2復(fù)合體的形成比率下降，癌細(xì)胞阻滯于S期，提示EVO通過誘導(dǎo)caspase依賴的細(xì)胞凋亡和S期阻滯來抑制癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖。

3 小結(jié)

近些年，EVO抗腫瘤作用成為研究熱點(diǎn)，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡進(jìn)行干預(yù)，抑制或增加腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而阻止腫瘤血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲等，但是信號(hào)通路并不是孤立地起作用的，而是相互聯(lián)系，一條信號(hào)通路的改變會(huì)引起另一條信號(hào)通路的改變。目前EVO抗癌活性的靶向性有兩點(diǎn)值得探討：（1）能夠區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，但并非對(duì)所有癌細(xì)胞都有殺傷作用，而是針對(duì)特定的癌細(xì)胞系有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，其立體結(jié)構(gòu)可能與其抗癌活性有密切關(guān)系。（2）EVO可特異性地識(shí)別某些癌細(xì)胞特有的表面或細(xì)胞內(nèi)受體蛋白，從而與其結(jié)合啟動(dòng)死亡途徑，靶向性的殺傷癌細(xì)胞。而這些特異性的受體或信號(hào)在EVO耐受的癌細(xì)胞或正常細(xì)胞因中不表達(dá)或表達(dá)較少，EVO無法啟動(dòng)死亡途徑從而不能影響該類細(xì)胞的生存。雖然近些年實(shí)驗(yàn)證明EVO的抗癌作用，其可能作為一種潛在的抗增殖藥物單獨(dú)用于結(jié)腸癌治療或作為一種佐劑，但因其水溶性低且體內(nèi)代謝速度快，半衰期短，應(yīng)用受到了限制，這些問題將有待解決。