細(xì)胞融合誘導(dǎo)EMT并生成乳腺癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展*

趙志正，劉碩，林洪生

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

乳腺癌是目前全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。據(jù)美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球新發(fā)乳腺癌病例210萬［1－2］，我國乳腺癌發(fā)病率也在逐年增長，且呈年輕化趨勢。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的首要原因［3－5］。隨著對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制認(rèn)識的不斷加深，越來越多的證據(jù)顯示，并非所有腫瘤細(xì)胞都具有轉(zhuǎn)移特性，腫瘤組織中小部分具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞——腫瘤干細(xì)胞決定著腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）獲取強(qiáng)侵襲和遷移能力［6］。近期，腫瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生和EMT的發(fā)生機(jī)制得以合理揭示。

研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是干細(xì)胞的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層［7］，具有低免疫原性和多能分化潛能，在組織工程、靶向治療和器官移植中應(yīng)用廣泛［8－9］。同時，MSCs也具有向受傷組織和腫瘤組織遷徙的特性，參與腫瘤微環(huán)境的形成，其機(jī)制可簡單概述為以下幾個方面：其一，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，如在肺鱗癌中分化為成纖維細(xì)胞，參與間質(zhì)形成，同時，通過改變細(xì)胞形態(tài)和減少細(xì)胞連接促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［10－11］。且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可與肺癌細(xì)胞融合，促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移［12］，而通過旁分泌促進(jìn)腫瘤發(fā)展也是其重要機(jī)制之一［13］；其二，與之相反，也有相關(guān)研究證實(shí)，BMSCs可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲，使細(xì)胞周期停滯，并誘導(dǎo)其凋亡［14］。故BMSCs在不同的癌種中可能起到相反的作用，然而大多數(shù)據(jù)來源于實(shí)驗(yàn)研究，具體是由于癌種的不同還是微環(huán)境的改變，尚需進(jìn)一步研究［15］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可通過細(xì)胞融合和細(xì)胞侵入式死亡的方式產(chǎn)生雜合體［16］，而腫瘤細(xì)胞可與其間質(zhì)中的“常客”——BMSCs發(fā)生細(xì)胞融合［17－20］，在這一過程中，BMSCs賦予腫瘤細(xì)胞“干性”，并給予其可編碼的間質(zhì)表型基因，即發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，從而獲取高侵襲和遷移特性，最終發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1 腫瘤干細(xì)胞是乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因

干細(xì)胞具有自我更新與增殖分化能力。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤組織中的絕大多數(shù)細(xì)胞增殖能力有限，不能自我更新，不會導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而其中極少數(shù)細(xì)胞卻具有自我更新、多能分化、多藥耐藥及強(qiáng)大的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這極少數(shù)的細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞，是引起腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因［21］。隨著腫瘤干細(xì)胞不斷從腫瘤中被分離出來，這一理論已在多種實(shí)體瘤中被證實(shí)，故研究認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的“種子”［22］。研究發(fā)現(xiàn)，從人類乳腺癌組織原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中分離出的CD44＋CD24－／low細(xì)胞亞群具有腫瘤干細(xì)胞特性，此為乳腺癌干細(xì)胞研究的開始［23］，其后又建立了側(cè)群細(xì)胞、無血清培養(yǎng)等多種分選方法，相關(guān)研究也由此逐漸展開。

2 EMT是腫瘤干細(xì)胞獲取轉(zhuǎn)移特性的重要環(huán)節(jié)

EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，并獲得侵襲和遷移能力的過程，上皮細(xì)胞在此過程中失去了細(xì)胞極性及與基底膜的連接，表現(xiàn)為N－鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上升，E－鈣黏蛋白、緊密連接蛋白Z0－1標(biāo)志物表達(dá)下降，從而使其有能力脫離腫瘤主體，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是腫瘤細(xì)胞局部浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［24－25］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，分化的上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，遷移和侵襲能力增強(qiáng)［26］，同時由于表觀遺傳學(xué)的改變，分化的上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為未分化狀態(tài)，不僅可以表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，而且可以獲得干細(xì)胞樣特征，如自我更新、增殖能力增強(qiáng)，尤其是侵襲、遷移能力增強(qiáng)。同時，研究指出，腫瘤干細(xì)胞更易發(fā)生EMT［27］，從人乳腺上皮分離出的干細(xì)胞也表達(dá)EMT標(biāo)志物，腫瘤干細(xì)胞中的多條EMT信號通路被異常激活，說明EMT和腫瘤干細(xì)胞之間存在直接聯(lián)系，共同促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而，腫瘤干細(xì)胞發(fā)生EMT的具體機(jī)制缺乏較為合理的假說，直到近期才有重要發(fā)現(xiàn)。

3 細(xì)胞融合是乳腺癌細(xì)胞獲得“干性”特質(zhì)及其發(fā)生EMT的根源

腫瘤干細(xì)胞的起源有多種學(xué)說，但均不能合理揭示腫瘤干細(xì)胞生成和EMT之間的關(guān)系。細(xì)胞融合是腫瘤細(xì)胞獲得高轉(zhuǎn)移活性的一種潛在機(jī)制，是指兩個或以上細(xì)胞融合為一個細(xì)胞的過程，在受精、胎盤形成、組織修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用［28－29］。實(shí)驗(yàn)研究表明，腫瘤干細(xì)胞源于腫瘤細(xì)胞和BMSCs的融合，并已在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌中被證實(shí)［30－32］。BMSCs來源于骨髓，被創(chuàng)傷、腫瘤炎癥微環(huán)境或者術(shù)后組織修復(fù)過程中大量趨化因子誘導(dǎo)，進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，并在炎癥微環(huán)境的不斷刺激下，與腫瘤細(xì)胞融合，進(jìn)而產(chǎn)生初代腫瘤干細(xì)胞。在這一過程中，親代腫瘤細(xì)胞基因組賦予子代細(xì)胞成瘤特性，而親代BMSCs基因組賦予子代細(xì)胞干細(xì)胞表型、間質(zhì)表型及高轉(zhuǎn)移活性，使子代細(xì)胞在具有干細(xì)胞特性的基礎(chǔ)上發(fā)生EMT［33］，同時伴有多種相關(guān)分子表達(dá)［34］。對于乳腺癌來說，啟動腫瘤干細(xì)胞的惡性侵襲特性，即會導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。這一假說不但合理揭示了腫瘤干細(xì)胞的起源，并且闡明了這一過程中EMT的發(fā)生機(jī)制，是目前研究的重要發(fā)現(xiàn)之一。

4 Wnt／β－catenin信號通路是維持腫瘤干細(xì)胞干性及EMT的核心通路

多條維持干細(xì)胞干性的信號通路在腫瘤干細(xì)胞中被激活，根據(jù)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的不同，其激活通路有所不同［35］。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt／β－catenin信號通路在維持乳腺癌干細(xì)胞干性方面具有重要作用，前期研究也證實(shí)了該通路的作用，是中藥干預(yù)的有效通路［36－38］。

同時，研究發(fā)現(xiàn)，Wnt／β－catenin是調(diào)控EMT發(fā)生發(fā)展的重要通路，如采用基因敲除法干擾Wnt／β－catenin信號通路，能夠顯著影響EMT介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)生，提示該通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要意義［39］。因此可推測，Wnt／β－catenin信號通路在BMSCs與乳腺癌細(xì)胞相互融合產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞及發(fā)生EMT的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。部分研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)乳腺癌中Wnt信號通路可調(diào)控腫瘤干細(xì)胞，同時抑制甚至逆轉(zhuǎn)EMT。抑制Wnt信號通路可使腫瘤細(xì)胞失去自我更新能力，并下調(diào)EMT相關(guān)基因的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制早期肺轉(zhuǎn)移［40］。因此，靶向干預(yù)該信號通路可能是控制乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要手段之一。

5 中醫(yī)藥在BMSCs與腫瘤交互作用中的研究進(jìn)展

目前，中醫(yī)藥相關(guān)研究仍集中于腫瘤微環(huán)境下BMSCs表型發(fā)生變化從而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移方面，缺乏對兩者融合產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在體外共培養(yǎng)條件下，BMSCs可以向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞分化，在形態(tài)學(xué)發(fā)生變化的同時提高增殖能力，以黃芪多糖干預(yù)后，BMSCs發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，生長周期減慢，同時，α－平滑肌肌動蛋白和成纖維細(xì)胞激活蛋白下調(diào)，在腫瘤微環(huán)境中維持了其穩(wěn)態(tài)［41］。經(jīng)典名方半夏瀉心湯及其拆方的含藥血清可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的BMSCs細(xì)胞進(jìn)入G1期，降低S期細(xì)胞比例，同時，全方組也明顯降低了c－MYC和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白表達(dá)水平，預(yù)防BMSCs在腫瘤微環(huán)境中的惡性轉(zhuǎn)化，一定程度上說明了中藥組方的合理性和科學(xué)性［42］。對中藥自擬方研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方扶正抑瘤方在腫瘤微環(huán)境中可下調(diào)細(xì)胞端粒酶活性，增強(qiáng)P53基因表達(dá)，中斷BMSCs向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢［43］。

雖然BMSCs在以上共培養(yǎng)體系中通過自身細(xì)胞形態(tài)的變化，發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用，但是其表型發(fā)生轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制，尤其是與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制及是否保留了其干性特點(diǎn)，更深層次來說，BMSCs是否是通過細(xì)胞融合獲得的細(xì)胞表型的變化，中藥復(fù)方干預(yù)其惡性潛質(zhì)的作用是否也是通過以上機(jī)制，仍是今后需進(jìn)一步深入研究的問題。

6 展望

BMSCs在不同的癌種和細(xì)胞系中可能起到相反的作用。有研究認(rèn)為，MSCs通過與腫瘤細(xì)胞融合降低了子代細(xì)胞的惡性侵襲和致瘤性，雜交細(xì)胞表現(xiàn)為生長抑制、凋亡增加和致瘤性降低等生物學(xué)特點(diǎn)［44］，如MSCs可在腫瘤間質(zhì)中同肝癌細(xì)胞自發(fā)融合，但是會導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降［45］。BMSCs可以有效抑制肝癌細(xì)胞H7402、HepG2的增殖及β－catenin、Bcl－2、c－Myc、PCNA和生長素的表達(dá)［46］。同時研究提示，MSCs對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用是由MSCs分泌的Wnt信號通路抑制蛋白dickkopp－1所介導(dǎo)的［47］。在癌前病變研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓來源細(xì)胞（bone marrow－derived cells，BMDCs）可以同正常的和轉(zhuǎn)化的腸上皮干細(xì)胞發(fā)生融合，卻未導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。MSCs對造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，且會抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程［48］。

總的來說，在特定的腫瘤細(xì)胞模型中，MSCs與腫瘤細(xì)胞融合可以抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，尤其是乳腺癌，說明MSCs融合可能在臨床治療腫瘤上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，靶向干預(yù)細(xì)胞融合信號通路可能是從根本上解決乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要手段之一。

前期拆方研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方及單體成分通過作用于Wnt信號通路干預(yù)腫瘤干細(xì)胞的自我更新，抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。同時，研究發(fā)現(xiàn)，采用西黃丸含藥血清能夠抑制Wnt信號通路，調(diào)控人肺癌干細(xì)胞增殖［38］。在腸癌中通過調(diào)控ZEB－1－SCRIB循環(huán)，調(diào)節(jié)E－鈣粘連蛋白、N－鈣粘連蛋白的表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生［39］，說明西黃丸可能是通過Wnt通路干預(yù)腫瘤干細(xì)胞干性的同時，影響EMT的發(fā)生。通過對活血化瘀類中藥研究發(fā)現(xiàn)，該類藥物干預(yù)腫瘤干細(xì)胞依賴于轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子／凝血因子VIIa信號通路，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移?？傊珺MSCss和腫瘤細(xì)胞的融合是產(chǎn)生腫瘤干細(xì)胞及發(fā)生EMT的根源，而Wnt／β－catenin信號通路是其核心通路，在乳腺癌術(shù)后長期干預(yù)過程中，通過抑制由細(xì)胞融合產(chǎn)生的初代乳腺癌干細(xì)胞生成，調(diào)控Wnt／β－catenin信號通路，干預(yù)其干細(xì)胞“干性”，中斷甚至逐步扭轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生，可從根源上控制腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。