超低溫冷凍同種異體軟骨的研究進(jìn)展

洪郭駒

(阿爾伯塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院，加拿大 埃德蒙頓 T6G 2R3)

超低溫冷凍是在極低溫度下冷卻和儲(chǔ)存細(xì)胞、組織或器官，以保持其生存能力的一種技術(shù)。超低溫冷凍通常會(huì)將捐贈(zèng)組織或器官在-80 ℃(某些情況下溫度為-196～-80 ℃)保存數(shù)月乃至數(shù)年[1]。與低溫保存(4～10 ℃)相比，超低溫冷凍同種異體軟骨可以極大地延緩?fù)N異體軟骨的新陳代謝，延長(zhǎng)其保存時(shí)間，增加其利用率[2-3]。然而，超低溫冷凍所產(chǎn)生的冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生負(fù)面影響，并可能降低軟骨細(xì)胞的活性和破壞細(xì)胞的完整性[4]。Pallante等[5]研究發(fā)現(xiàn)，低溫冷凍的同種異體軟骨在軟骨的承重功能、軟骨細(xì)胞的活性和基質(zhì)含量等方面與新鮮軟骨一致；相比之下，超低溫冷凍軟骨的硬度較低溫保存軟骨降低了80%，基質(zhì)含量降低了55%，細(xì)胞活性降低了96%[3]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，超低溫冷凍很難保存同種異體軟骨[3，6-7]。盡管超低溫冷凍技術(shù)目前還不成熟，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，它在未來(lái)的組織保存領(lǐng)域仍具有極大的潛力。本文從同種異體軟骨的超低溫冷凍法和超低溫冷凍同種異體軟骨的臨床應(yīng)用2個(gè)方面對(duì)超低溫冷凍同種異體軟骨的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 同種異體軟骨的超低溫冷凍法

同種異體軟骨的超低溫冷凍法主要包括慢速冷凍法和快速冷凍法。這2種方法的主要負(fù)面作用是冷卻過(guò)程中形成的結(jié)晶物質(zhì)會(huì)傷害正常組織[8-9]。如冷凍保存中所形成的冰晶，可能會(huì)損壞軟骨的成分、結(jié)構(gòu)及其性能[10]。Muldrew等[11]總結(jié)了超低溫冷凍方法可能會(huì)破壞細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)制：一是異常冷卻導(dǎo)致冰核產(chǎn)生，這會(huì)形成軟骨中的冰層面，阻止冷凍保護(hù)溶液從外向內(nèi)擴(kuò)散；二是冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的冰晶會(huì)破壞纖維連接蛋白片段和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，并觸發(fā)基質(zhì)降解蛋白酶的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？焖倮鋬鲞^(guò)程中添加冷凍保護(hù)劑，有助于防止超低溫冷凍過(guò)程中組織結(jié)冰[10]，這也是快速冷凍較慢速冷凍同種異體軟骨在維持軟骨細(xì)胞活性方面效果更佳的重要原因[12]。

目前，快速冷凍法主要指玻璃化冷凍技術(shù)[1，3]。玻璃化冷凍過(guò)程除了在冷凍速度上加快，還會(huì)添加一定濃度的冷凍保護(hù)劑[13-14]。當(dāng)溫度快速降低時(shí)，組織會(huì)迅速產(chǎn)生玻璃樣變化，從而對(duì)組織起到保護(hù)作用，其原因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑可以避免組織內(nèi)冰晶的形成[13，15]。玻璃化冷凍技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)組織保存，減少組織的熱傳遞，節(jié)省組織降溫時(shí)間，避免組織受到損壞[9]。在組織的玻璃化保存過(guò)程中會(huì)添加不同濃度的冷凍保護(hù)劑，以減少在超低溫條件下冰晶的形成，但冷凍保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而選擇何種濃度的冷凍保護(hù)劑最佳至今尚無(wú)定論[9，16-17]。目前，玻璃化冷凍過(guò)程中所采用的冷凍保護(hù)劑的總量通常為總?cè)芤旱?0%～60%[3，14]。二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)[18]、甘油(glycerol，GC)[7]、丙二醇(propylene glycol，PG)[19]、乙二醇(ethylene glycol，EG)[7]和甲酰胺(formamide，F(xiàn)M)[16]這幾種冷凍保護(hù)劑已被證明可用于細(xì)胞、組織和器官的冷凍保存中[20]。DMSO可提高軟骨細(xì)胞的存活率[18]。在超低溫度條件下，DMSO對(duì)保存的軟骨細(xì)胞沒(méi)有毒性，甚至可以維持細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)[21]。Jomha等[16]分離出豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并將DMSO、EG、PG、GC和FM這5種冷凍保護(hù)劑分別以1 mol·L-1和3 mol·L-1的濃度對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為1 mol·L-1時(shí)這5種冷凍保護(hù)劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但濃度為3 mol·L-1時(shí)，可觀察到這5種冷凍保護(hù)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒性，且EG和GC對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性低于PG、DMSO和FM。在另一項(xiàng)研究中，F(xiàn)ahmy等[19]將從人體分離出來(lái)的軟骨片暴露于上述5種冷凍保護(hù)劑中，并設(shè)置不同的濃度梯度；結(jié)果顯示，冷凍保護(hù)劑的濃度與細(xì)胞損傷之間并不存在線性關(guān)系，但是在逐步提高冷凍保護(hù)劑濃度的過(guò)程中，可以發(fā)現(xiàn)添加GC時(shí)細(xì)胞活性最低，其次是PG和DMSO，而EG的毒性最小。

玻璃化冷凍的效果是否與冷凍保護(hù)劑的使用策略有關(guān)，目前仍存在爭(zhēng)議。Jomha等[16]研究認(rèn)為，使用濃度為3 mol·L-1的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行120 min的超低溫冷凍所造成的細(xì)胞毒性較高，而降低冷凍保護(hù)劑的濃度或減少其擴(kuò)散時(shí)間，都能減少細(xì)胞毒性。在Forriol等[22]的研究中，同種異體軟骨被分別保存在不同的溶液(包含DMSO或不包含DMSO)、不同的冷凍溫度(-80 ℃或-186 ℃)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在行軟骨移植的成年綿羊模型中，軟骨細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯差異。Jomha等[16]建立了多種冷凍保護(hù)劑組合的不同超低溫冷凍策略，其中包括20種雙冷凍保護(hù)劑方案和15種三冷凍保護(hù)劑方案，結(jié)果顯示在不同冷凍保護(hù)劑組合下，各個(gè)方案在維持細(xì)胞膜的完整性及其代謝活性方面存在差異，其中EG-Me2SO-Gly組合方案可有效提高軟骨細(xì)胞的存活率。Brockbank等[14]也認(rèn)為，EG、FM和PG的不同組合，可提高軟骨細(xì)胞的存活率，有助于全層厚度軟骨的保存。

冷凍保護(hù)劑在組織內(nèi)的擴(kuò)散也是影響玻璃化冷凍同種異體軟骨效果的因素之一[2，23]。由于冷凍保護(hù)劑的擴(kuò)散極大地受限于軟骨組織的厚度，這可能導(dǎo)致冷凍保護(hù)劑在軟骨內(nèi)的分布不均，進(jìn)而導(dǎo)致同種異體軟骨深層區(qū)域的過(guò)度冰凍[17]。冷凍保護(hù)劑擴(kuò)散率的計(jì)算一般采用物理學(xué)上的Fick定律，該定律也是首先用于計(jì)算DMSO在組織中分布和擴(kuò)散的應(yīng)用型定律[23-24]。Zhang等[17]采用三相模型來(lái)計(jì)算冷凍保護(hù)劑的擴(kuò)散率，并將其計(jì)算結(jié)果與Fick定律計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示在計(jì)算軟骨中冷凍保護(hù)劑的擴(kuò)散率時(shí)，三相模型計(jì)算的結(jié)果與Fick定律計(jì)算的結(jié)果沒(méi)有明顯差異。但是，也有研究者指出，用Fick定律計(jì)算時(shí)低估了冷凍保護(hù)劑的分布，這就意味著用Fick定律計(jì)算冷凍保護(hù)劑在組織中的擴(kuò)散率可能會(huì)導(dǎo)致誤差[23]。Abazari等[25]通過(guò)MRI測(cè)量軟骨中DMSO的滲透量，結(jié)果顯示基質(zhì)膠原蛋白對(duì)冷凍保護(hù)劑在組織內(nèi)的擴(kuò)散和分布阻礙較小。Abazari等[26]將非理想溶液的熱力學(xué)參數(shù)和天然膠原蛋白的參數(shù)整合到原始生物力學(xué)模型中，以更準(zhǔn)確的方式模擬冷凍保護(hù)劑的真實(shí)狀態(tài)，結(jié)果顯示當(dāng)冷凍保護(hù)劑在組織擴(kuò)散時(shí)，軟骨會(huì)承受動(dòng)態(tài)收縮應(yīng)力，并導(dǎo)致冷凍保護(hù)劑的滲透失衡。

除此之外，還有其他因素也可以對(duì)玻璃化冷凍同種異體軟骨的效果產(chǎn)生影響。Wu等[27]通過(guò)比較多種冷凍保護(hù)劑的不同組合發(fā)現(xiàn)，玻璃化作用的效果不僅與冷凍保護(hù)劑的擴(kuò)散率相關(guān)，還與冷凍軟骨時(shí)所用容器的導(dǎo)熱性相關(guān)。Wu等[28]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素、氨基葡萄糖、2,3,5,6-四甲基吡嗪和抗壞血酸這4種添加劑可改善暴露在高濃度冷凍保護(hù)劑中的軟骨細(xì)胞存活率，這為優(yōu)化玻璃化冷凍同種異體軟骨方案又提供了新的認(rèn)識(shí)。

2 超低溫冷凍同種異體軟骨的臨床應(yīng)用

目前，有關(guān)低溫保存同種異體軟骨的研究已取得了較豐富的成果[29-31]；而有關(guān)超低溫冷凍同種異體軟骨的研究還相對(duì)較少，將超低溫冷凍方法用于臨床試驗(yàn)中并實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[1，32]。

與骨骼組織不同，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)神經(jīng)、血管和淋巴管，是軟骨細(xì)胞附著于基質(zhì)上的一種組織結(jié)構(gòu)[33]。既往的研究已表明，按照超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)流程保存同種異體軟骨，可以較好地維持分離后的軟骨細(xì)胞活力[34-35]，而在維持整個(gè)軟骨組織的活性方面效果較差[13]。因此，從簡(jiǎn)單細(xì)胞的超低溫冷凍保存到完整組織的超低溫冷凍保存仍充滿挑戰(zhàn)。玻璃化冷凍是在極快降溫過(guò)程中，將冷凍保護(hù)液從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轲ざ群芨叩念?lèi)似玻璃狀的固態(tài)，此過(guò)程可避免細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，減少組織破壞，因此它被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)軟骨超低溫冷凍的關(guān)鍵途徑[3，9，36]。目前，已經(jīng)有研究者成功地將關(guān)節(jié)軟骨玻璃化，以長(zhǎng)期有效地保存軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)[2]。但無(wú)論如何，從簡(jiǎn)單的細(xì)胞到組織再到器官的超低溫冷凍保存，都需獲得更多的研究數(shù)據(jù)來(lái)支撐其進(jìn)入臨床應(yīng)用的安全性和有效性。

目前，盡管玻璃化冷凍技術(shù)仍處于探索階段，但是超低溫冷凍法已被運(yùn)用于臨床實(shí)踐。這些超低溫冷凍方法一般不如玻璃化冷凍技術(shù)精細(xì)，也較少采用復(fù)雜的冷凍保護(hù)劑組合。Pearsall等[37]對(duì)采用超低溫冷凍的同種異體軟骨移植與自體軟骨移植進(jìn)行了臨床療效比較，結(jié)果顯示兩者在關(guān)節(jié)功能改善方面無(wú)明顯差異，而唯一對(duì)臨床療效產(chǎn)生影響的相關(guān)因素是患者的年齡。Abrams等[38]采用超低溫冷凍同種異體膝關(guān)節(jié)軟骨(連同半月板組織)，以用于膝關(guān)節(jié)移植手術(shù)；結(jié)果顯示，在32例受體患者中有23例患者行移植術(shù)后膝關(guān)節(jié)功能得到改善，但隨訪結(jié)束后這23例患者的二次手術(shù)率高達(dá)25%。

近年來(lái)，超低溫冷凍同種異體軟骨移植取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。超低溫冷凍同種異體軟骨移植可以為治療關(guān)節(jié)軟骨病變提供可能性。Geraghty等[39]將一種超低溫冷凍條件下的網(wǎng)狀有孔同種異體軟骨片運(yùn)用于臨床移植術(shù)中，結(jié)果顯示該種同種異體軟骨可促進(jìn)軟骨受損區(qū)域中間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)，且同種異體軟骨中的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白均獲得了較好的保護(hù)。Vangsness等[40]將網(wǎng)狀有孔的超低溫冷凍同種異體軟骨移植于膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者中，隨訪2年后發(fā)現(xiàn)，受體患者膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)良好；認(rèn)為在超低溫冷凍過(guò)程中，軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)和軟骨生長(zhǎng)因子都得到了較好的維持；并提出同種異體軟骨在較厚的部位可以采用有孔設(shè)計(jì)，不僅有利于冷凍保護(hù)劑向移植物的擴(kuò)散，還可以提高其柔韌性，從而在匹配軟骨缺損時(shí)可以獲得更多的表面接觸。上述研究也得到了Woodmass等[41]的論證與支持，他們認(rèn)為這種超低溫冷凍網(wǎng)狀軟骨適用于2 cm2以內(nèi)的軟骨缺損，而韌帶或半月板損傷嚴(yán)重的患者應(yīng)排除在外；并強(qiáng)調(diào)術(shù)后6周內(nèi)需部分負(fù)重行走和適度的關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)，術(shù)后6周至4個(gè)月應(yīng)在膝關(guān)節(jié)支架的支撐下逐漸負(fù)重，術(shù)后4個(gè)月膝關(guān)節(jié)可正常運(yùn)動(dòng)。這種網(wǎng)狀有孔結(jié)構(gòu)的超低溫冷凍同種異體軟骨具有突破性的實(shí)踐價(jià)值，它使超低溫冷凍從基礎(chǔ)研究正式邁向臨床實(shí)踐。然而，這種網(wǎng)狀有孔軟骨并非最終選擇，骨外科醫(yī)生仍期望可以有如在低溫保存領(lǐng)域當(dāng)中的那種較為完整的軟骨。

3 小 結(jié)

同種異體軟骨使用量的增長(zhǎng)與其保存技術(shù)的進(jìn)步密切相關(guān)。超低溫冷凍技術(shù)，特別是添加冷凍保護(hù)劑的玻璃化冷凍技術(shù)，將完全改變同種異體軟骨移植的現(xiàn)狀。但是，目前超低溫冷凍技術(shù)仍處于探索階段，缺乏成熟的臨床轉(zhuǎn)化條件。隨著超低溫冷凍體系和方法的逐步建立，以及超低溫冷凍概念和理念的逐步革新，超低溫冷凍技術(shù)在未來(lái)將作為保存同種異體軟骨的一種主流選擇而普遍適用于臨床。