納米材料靶向血栓多模態(tài)顯像及溶栓治療研究進(jìn)展

鄭廣榮，王洪津

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116023

血栓是引發(fā)缺血性腦卒中及心肌梗死的主要病因[1]。腦卒中是我國(guó)單病種中發(fā)病率、病死率和致殘率最高的疾病，給社會(huì)、家庭和患者帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨大痛苦[2-3]。缺血性腦卒中在臨床中的治療原則為早診斷、早治療、早康復(fù)和預(yù)防再發(fā)，而早診斷則依賴(lài)于影像學(xué)的輔助，如超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)、數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等。但這些傳統(tǒng)的成像技術(shù)對(duì)于血栓疾病診斷的特異性及敏感性較低，常錯(cuò)過(guò)黃金診治期，對(duì)患者的預(yù)后極為不利。分子影像學(xué)(molecular imaging，MI)是將分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)影像學(xué)相結(jié)合，從細(xì)胞和分子水平對(duì)病灶進(jìn)行定性和定量的可視化研究，著力于探測(cè)疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，其核心要素是高分辨成像設(shè)備和高靈敏度、高特異性的靶向探針[4]。Torchilin[5]提出了靶向治療的概念，即定向遞送包裹藥物的納米粒實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)釋放治療，而靶向遞送、釋放、治療效果則由MI來(lái)監(jiān)控。這種利用不同納米材料合成出多種靶向顯像劑，且可以成立多種遞藥系統(tǒng)的新手段，為血栓疾病早期的精準(zhǔn)診斷及治療提供了新思路。現(xiàn)就血栓靶向成像及治療的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 物理靶向

1.1 磁性靶向 Inada等[6]將磁性靶向給藥系統(tǒng)與尿激酶偶聯(lián)運(yùn)用于血栓治療，其具有較強(qiáng)的纖維蛋白溶解活性，該磁性納米粒在外部磁場(chǎng)的引導(dǎo)作用下能精準(zhǔn)到達(dá)血栓部位，釋放尿激酶進(jìn)行溶栓治療。在前者研究的基礎(chǔ)上，Torchilin等[7]及Bi等[8]使用氧化鐵分別與鏈激酶、尿激酶結(jié)合，制備成相應(yīng)的磁性靶向納米粒，該磁性靶向納米粒的溶栓效率明顯高于傳統(tǒng)藥物注射溶栓；此外，磁性納米粒的靶向作用降低了全身性纖溶酶原激活和繼發(fā)的血漿纖維蛋白原降解，從而降低溶栓藥物的不良反應(yīng)。

超順磁性氧化鐵納米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)的出現(xiàn)為納米材料提供了新選擇。Heid等[9]合成了由葡聚糖作為外殼的SPIONs，并將不同濃度的組織型纖溶酶原激活劑(tissue type PA，tPA)固定在納米顆粒上，通過(guò)外部磁場(chǎng)引導(dǎo)tPA到血栓部位進(jìn)行溶栓治療。SPIONs除了可以完成傳統(tǒng)的磁靶向及藥物遞送外，還可用于MRI成像，對(duì)治療效果進(jìn)行監(jiān)控。姚瓊[10]利用SPIONs為基礎(chǔ)材料對(duì)小鼠的頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行MRI成像，可以清晰地觀察到治療前后頸動(dòng)脈斑塊處變化。

Cheng等[11]利用磁性納米載體具有的機(jī)械攪拌作用，制備出可以磁性活化的鎳納米棒，并將tPA溶液與磁性鎳納米棒懸浮液混合，通過(guò)外加旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)來(lái)遠(yuǎn)程旋轉(zhuǎn)鎳納米棒。在外加磁場(chǎng)的作用下產(chǎn)生的機(jī)械攪拌力加速tPA在纖維蛋白表面的遷移擴(kuò)散，從而較低藥物濃度的tPA即可獲得有效的溶栓效果。Tasci等[12]利用氧化鐵和tPA制備“膠體渦輪”，通過(guò)攪拌作用在血栓塊表面產(chǎn)生一定的穿透力，破壞局部血栓，同時(shí)將“膠體渦輪”中所攜帶的tPA釋放，更有利于其滲入血栓中，更好地溶栓。

1.2 剪切力靶向 血液流動(dòng)時(shí)與血管內(nèi)壁產(chǎn)生的摩擦力稱(chēng)作剪切力，正常血管內(nèi)壁光滑，管徑均勻，剪切力約為1.5 Pa[13-14]。血小板(platelet，PLT)具備一定的剪切力敏感性。血栓形成的血管狹窄使局部血管剪切力升高10～100倍，剪切力的驟然升高促使PLT加速聚集，其表面形成膜鏈結(jié)構(gòu)。聚集后的PLT經(jīng)過(guò)剪切力減小的部位時(shí)，膜鏈重組，PLT聚集強(qiáng)度及穩(wěn)定性增加，促進(jìn)血栓生長(zhǎng)并加固血栓穩(wěn)定性[15-16]。

Korin等[17]利用血栓區(qū)域剪切力的變化，制備出基于剪切力激活納米治療系統(tǒng)(SA-NTs)，利用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)為仿生材料制備出類(lèi)似PLT大小的納米泡，在內(nèi)部標(biāo)記熒光，通過(guò)體外三維流體模型模擬90%血管狹窄時(shí)，狹窄區(qū)域產(chǎn)生明顯熒光，證明制備的納米泡具有相應(yīng)的剪切力靶向作用。將tPA通過(guò)碳亞二胺法連接至納米泡上合成出的SA-NTs對(duì)血栓具有較好的靶向性和治療效果，其潛在優(yōu)勢(shì)在于降低藥物劑量，更好的保證安全性?？虑賉18]應(yīng)用功能性磷脂1,3-二棕櫚酰胺磷脂酰膽堿為基礎(chǔ)材料，合成剪切力敏感型脂質(zhì)體(shear-stress sensitive liposomes，SSSL)，脂質(zhì)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)與血小板膜更為相似，具有較好的剪切力靶向作用，同時(shí)也擁有更高的生物安全特性。在體外及小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓模型中均驗(yàn)證了SSSL擁有較強(qiáng)的血栓區(qū)域靶向作用。

2 化學(xué)修飾靶向

2.1 血小板靶向 PLT是止血和血栓形成的關(guān)鍵細(xì)胞，其表面具有多種糖蛋白，這些特異性糖蛋白被廣泛用于血栓的靶點(diǎn)。血小板GPIIb/IIIa受體(CD41/CD61)，也稱(chēng)為整合素αIIbβ3，是PLT表面表達(dá)最豐富的受體。活化的PLT可以通過(guò)整合素αlIbβ3與纖維蛋白原之間的橋聯(lián)作用進(jìn)行聚集，使血栓快速變大。Huang等[19]合成了RGT多肽分子，并證實(shí)該多肽分子可以較好地靶向c-Src/β3，這提示c-Src/β3可以成為抗血栓形成的靶點(diǎn)。Wang等[20]構(gòu)建出單鏈抗體(scFvs)，其可以特異性結(jié)合血小板上高表達(dá)的整合素αIIbβ3，將重組單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(scuPA)與scFvs結(jié)合，制備出兼具診斷與治療功能的超聲造影劑，該新型造影劑對(duì)血栓具有較高的靶向性，超聲監(jiān)控下直觀其溶栓效果與尿激酶類(lèi)似，同時(shí)避免了傳統(tǒng)尿激酶延長(zhǎng)出血時(shí)間的不良反應(yīng)。

血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa受體也是PLT活化的一種生物標(biāo)志，可作為纖維蛋白原的α鏈和γ鏈的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的結(jié)合受體。Schumann等[21]利用RGD修飾脂質(zhì)體微泡，構(gòu)建出靶向血栓的超聲造影劑，該造影劑增加了剪切力較低及血液流速較慢區(qū)域的血栓靶向能力。Hua等[22]及Mu等[23]分別將tPA和尿激酶包裹進(jìn)表面有RGD肽段修飾的超聲造影劑中，進(jìn)行體外靶向溶栓。Wang等[24]將連接有RGD肽的殼聚糖膜(chitosan,CS)修飾于包裹溶栓藥物的PLGA納米粒表面，同樣可實(shí)現(xiàn)靶向溶栓。Tang等[25]證實(shí)，相比線狀RGD，環(huán)狀RGD(cRGD)對(duì)激活的血小板GPIIb/IIIa受體有更強(qiáng)的靶向性。周君[26]利用cRGD的靶向能力，合成Fe304-PLGA-rtPA/CS-cRGD，呈多層球形結(jié)構(gòu)，外層CS-cRGD具有較強(qiáng)的靶向血栓能力，而其內(nèi)包裹的超順磁性Fe304為病灶的MRI監(jiān)控提供了可行性，球體結(jié)構(gòu)的核心區(qū)域rtPA提供溶栓功能。

P-選擇素糖蛋白在血栓形成中具有重要意義，可作為早期血栓的檢測(cè)標(biāo)記[27]。Juenet等[28]提出，巖藻依聚糖可以作為P-選擇素的多糖配體，靶向識(shí)別血栓中的PLT。利用巖藻依聚糖修飾的仿生納米粒表面共價(jià)結(jié)合rtPA，具有良好的血栓靶向特性，合成的納米粒對(duì)血栓具有良好的治療效果。將同位素標(biāo)記的巖藻依聚糖制成納米材料，利用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描顯影技術(shù)追蹤納米粒靶向血栓，為今后的溶栓治療提供了新的方向。

2.2 纖維蛋白(原)靶向 纖維蛋白參與所有類(lèi)型的血栓形成，是血栓形成的重要組成成分，且游離血液中含量較低，可成為血栓的一種靶點(diǎn)[29]。腫瘤間質(zhì)纖維蛋白的歸巢肽(cys-arg-glu-lys-ala，CREKA)能與血管中凝固血漿的纖維蛋白特異結(jié)合[30]。Song等[31]將CREKA結(jié)合在熒光標(biāo)記的SPIONs表面，制備能同時(shí)應(yīng)用于MRI及近紅外熒光成像的造影劑，其能更好地檢測(cè)出微血栓的存在。Zhong等[32]利用CREKA的靶向能力制備出Fe3O4-PLGA-PFH-CREKA納米粒，兼具M(jìn)RI造影劑及溶栓治療功效，該研究創(chuàng)新性地使用相變材料PFH，可以在超聲等裝置激發(fā)下產(chǎn)生物理相變，釋放能量擊碎血栓。

GPSRPP及GPRPP多肽對(duì)纖維蛋白具有高親和力。McCarthy等[33]設(shè)計(jì)了交聯(lián)葡聚糖包被的氧化鐵(CLIO)納米顆粒，并分別在納米粒表面修飾可以靶向到纖維蛋白的多肽GPRPP及GPSRPP，這兩種多肽修飾的納米粒均對(duì)血栓具有較強(qiáng)的靶向能力，且CLIO-多肽GPRPP是CLIO-多肽GPSPP靶向能力的1.6倍。與cRGD相似，環(huán)狀的多肽可以提高受體和肽段的親和性及穩(wěn)定性。Rezaeianpour等[34]利用二硫鍵將GPRPP環(huán)化，同時(shí)將直肽和環(huán)肽綴合Tc-99m，證實(shí)其顯影效果優(yōu)于連接直肽的造影劑。 凝血因子X(jué)IIIa是血栓形成早期急性血栓形成的標(biāo)志。McCarthy等[35]在CLIO表面修飾可以靶向到纖維蛋白的短肽配體(F XIII)，并通過(guò)聚乙二醇(PEG)連接溶栓藥物(如tPA等)，得到CLIO-F XIII-PEG-tPA，結(jié)果表明，F(xiàn) XIII靶向納米制劑可以靶向新生的血栓凝塊并溶解血栓。此外，Kim等[36]設(shè)計(jì)了由PEG殼聚糖修飾的金納米粒作為載體，結(jié)合了靶向纖維蛋白的多肽鏈的新型CT造影劑，其在血栓區(qū)域表現(xiàn)為明顯的高密度影，這不僅能直接檢測(cè)腦血管的栓子，及時(shí)檢測(cè)和量化腦血栓，還能指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)溶栓治療，反映組織情況。

2.3 凝血酶靶向 區(qū)分新鮮和陳舊性血栓有助于臨床對(duì)血栓性疾病的診治。凝血酶是血栓形成的關(guān)鍵之一，且僅在新鮮血栓中存在。Ta等[37]設(shè)計(jì)出能區(qū)分栓齡的智能型T1/T2雙序列MRI造影劑(以氧化鐵為核心，Gd-DTPA與靶向纖維蛋白的多肽連接)，當(dāng)遇到新鮮血栓時(shí)，凝血酶分解掉剪切性多肽，血栓區(qū)域有T1信號(hào)而無(wú)T2信號(hào)；遇到陳舊性血栓時(shí)，該區(qū)域顯示T2信號(hào)，而無(wú)T1信號(hào)，這種智能型檢測(cè)血栓的方式可作為未來(lái)的研究方向。同時(shí)，Kwon等[38]開(kāi)發(fā)了一種新的靶向活化凝血酶的熒光肽(TAP)，將TAP與包覆硅的金納米顆粒結(jié)合后制備出一種新型納米粒(TAP-SiO2@AuNPs)，該納米粒具有良好的熒光淬滅作用，可以近紅外熒光成像。凝血酶存在時(shí)，熒光強(qiáng)度比沒(méi)有凝血酶存在時(shí)高30.31倍，這是由于淬滅的TAP分子在金納米粒子表面的血栓特異性裂解，而CT可以直接顯示該新型納米粒靶向血栓。

3 生物靶向

血栓形成及抗血栓過(guò)程極其復(fù)雜，物理及化學(xué)修飾的靶向血栓納米粒仍存在一定的局限性，如靶點(diǎn)單一、生物安全性不夠高、機(jī)體排異、形態(tài)及柔軟度不夠等問(wèn)題。PLT能向血管邊緣及損傷處運(yùn)輸集結(jié)，是天然的靶向血栓的載體。Anselmo等[39]利用仿生的設(shè)計(jì)思路，以PEG納米顆粒為原材料制備出與天然PLT形態(tài)相似的中空內(nèi)芯柔軟圓盤(pán)狀顆粒材料，并在其表面修飾膠原結(jié)合肽、vWF因子結(jié)合肽和線性纖維蛋白原模擬肽。在3種肽協(xié)同介導(dǎo)下的納米粒能穩(wěn)定的靶向并黏附血栓，起到較好的靶向及溶栓作用。多肽介導(dǎo)系統(tǒng)的加入也大大增加了仿PLT形態(tài)納米粒的靶向能力。

人工制備的仿生PLT雖然可以在一定程度上降低機(jī)體的排異，增加靶向性，但仍無(wú)法與天然的PLT膜媲美。天然的PLT膜表面有更多的信號(hào)識(shí)別分子，可以逃過(guò)機(jī)體的免疫屏障，與血栓部位細(xì)胞及蛋白等多種物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)作用。Hu等[40]分離血液中的PLT，通過(guò)反復(fù)凍融制得所需PLT膜，在其內(nèi)部包被PLGA納米粒，制成PNPs仿生納米粒，其表面為天然的PLT膜，保留有多種具有識(shí)別及黏附功能的蛋白類(lèi)物質(zhì)，高仿生性使其生物相容性及靶向性均有巨大提升。陳文婷[41]利用介孔材料負(fù)載量大的特點(diǎn)，在介孔氧化硅空洞中吸附Fe3O4制得載Fe3O4空心介孔氧化硅囊(OSNCs)納米粒，并利用PLT的吞噬功能標(biāo)記PLT；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射OSNCs@PLT組的大鼠MRI成像效果明顯高于OSNCs和純PLT組，這說(shuō)明利用PLT靶向血栓成像的設(shè)想是可行的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)未來(lái)利用OSNCs@PLT內(nèi)空腔載入溶栓藥物進(jìn)行溶栓治療提供了可能。

4 總結(jié)與展望

納米材料靶向血栓成像及溶栓治療的早期研究主要著重于材料的靶向性，對(duì)靶向能力的探索則相對(duì)較少。較早的磁性納米粒對(duì)血栓有一定的靶向作用，但這種被動(dòng)靶向機(jī)制使其尋靶力較低，病灶顯像及治療效果欠佳，且受限于受病灶位置深度。隨著研究的不斷深入，對(duì)血栓中的血小板、纖維蛋白及溶血酶的靶向研究逐漸被關(guān)注。利用血栓本身的生物化學(xué)特性，在納米粒的表面連接肽鏈等靶向分子，一種以抗原-抗體結(jié)合為主要連接方式的主動(dòng)靶向方式被廣大學(xué)者接受。與被動(dòng)靶向方式比較，主動(dòng)靶向的納米粒擁有更高的尋靶力及精準(zhǔn)度。雖然化學(xué)修飾的納米材料在進(jìn)行不斷的優(yōu)化，兼具一定的生物安全性，但與天然生物源性細(xì)胞膜相比仍存在差距。而仿生性及生物安全性更高的納米材料，如脂質(zhì)體、血小板膜等，這種生物方法修飾的新型生物靶向納米材料擁有幾乎全部的血栓靶向分子，且其可以輕松逃避免疫系統(tǒng)，起到強(qiáng)靶向、高載藥、高顯像、高溶栓的作用。這種生物靶向的方式也將成為未來(lái)對(duì)血栓早預(yù)防、早診斷、早治療的新方向，值得深入研究。