miRNA 對肝纖維化TGF-β/smad 信號通路的影響

馬楚晗，于亞男，劉啟文，車華松，趙加梅，胡秋霞，成家茂

大理大學(xué) 1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，云南 大理 671000

肝纖維化由多種因素導(dǎo)致肝實質(zhì)細胞壞死和膠原纖維異常沉積，以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過量產(chǎn)生和沉積為主要表現(xiàn)，若不積極干預(yù)則有可能發(fā)展為肝硬化或肝癌。miRNA 是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，已有研究證實miRNA的異常表達與肝炎、肝硬化和惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)[1,2]。近年的研究表明，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中TGF-β/Smad 信號通路發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2～4]；而該信號通路相關(guān)miRNAs 的調(diào)控是近年來新發(fā)現(xiàn)的基因表達調(diào)控方式，在調(diào)控不同狀態(tài)的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）功能方面發(fā)揮決定性的作用，多種與TGF-β/Smad 信號通路相關(guān)聯(lián)的miRNA 如miR-19b、miR-33a、miR-130a/b、miR-200a、miR-101等，在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用[5]。miRNAs 與TGF-β/Smad 信號通路之間關(guān)系的研究不多，本文在此對近年的相關(guān)研究予以綜述。

1 TGF-β/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化中的作用機制

活化的HSCs 是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中最為關(guān)鍵的細胞之一，是ECM 的主要來源[6,7]。HSCs 在正常肝組織中處于靜息狀態(tài)，在嚴重肝病或肝受損時則被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞（myo-fibroblaster，MFB）；后者能產(chǎn)生大量ECM 并過量沉積，導(dǎo)致正常的肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，進而發(fā)生肝纖維化[8,9]。TGF-β/Smad 是肝纖維化的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可抑制正常肝細胞增殖[3]，激發(fā)HSCs 的活化，從而促進ECM 的生成和沉積[10,11]；其中TGF-β1是促進肝纖維化的核心細胞因子，主要分布于正常肝的竇內(nèi)皮細胞、Kupffer 細胞（KCs）中，其次為活化的HSCs 內(nèi)，在肝纖維化過程中HSCs 表達TGF-β1水平持續(xù)升高[10]。

TGF-β/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要在肝纖維化的炎性和炎癥后階段發(fā)揮作用。在炎性階段，KCs 被激活，促使細胞因子TGF-β1、PDGF、EGF 等大量釋放，刺激活化的HSCs 轉(zhuǎn)化為MFB；在炎癥后階段，HSCs 及MFB 可自分泌TGF-β1、TNF-α等因子，進一步促進自身活化[12]。在肝纖維化中，Smad 蛋白家族中的Smad3和Smad4蛋白可形成復(fù)合體轉(zhuǎn)位到細胞核中參與基因的調(diào)控，具有促纖維化作用；而Smad2和Smad7可以終止TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有保護作用[4,10]。

肝細胞或HSCs 中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱可有效抑制肝纖維化[13]。TGF-β活化后與細胞膜表面受體TGF-β Ⅱ型受體（TβRⅡ）結(jié)合，使之磷酸化而具有激酶活性，然后再招募結(jié)合TGF-β I 型受體（TβRI）形成二聚體受體復(fù)合物，并使TβRI 磷酸化具有激酶活性，活化的TβRI 進一步磷酸化其受體Smad蛋白[13,14]。Smad 蛋白家族包括3類：受體調(diào)節(jié)型Smads（RSmads），主要為Smad2、Smad3，可與活化的TβRI 直接作用并被磷酸化激活；共同調(diào)節(jié)型Smads（Co-Smads），主要為Smad4，能使Smad 復(fù)合物保持有效的轉(zhuǎn)錄活性；抑制性Smads（ISmads），主要有Smad6和Smad7，能競爭性結(jié)合TβRI，阻止RSmads 磷酸化[14]。R-Smads 和Co-Smads 均存在于胞質(zhì)中，二者結(jié)合成復(fù)合物后向胞核內(nèi)聚集，并通過和其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，或直接與DNA 結(jié)合來調(diào)節(jié)特定靶基因（如I 型膠原蛋白）的表達；TGF-β活化的同時，I-Smads 則與R-Smads 競爭性結(jié)合受體，反饋性抑制TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14,15]。

2 miRNA 對肝纖維化中TGF-β/smad 信號通路的調(diào)節(jié)

2.1 miRNA 的存在形式、特性及其作用

miRNA 是一類長約20～24個核苷酸的內(nèi)生性非編碼小RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控。miRNA 自1993年被發(fā)現(xiàn)以來，已在動、植物及人類等真核生物中獲得鑒定、識別的有近500種。miRNA 存在多種形式，可分為原始miRNA（primiRNA）、miRNA 前 體（pre-miRNA）和成熟miRNA（mtmiRNA）共3類。miRNA 的初級轉(zhuǎn)錄物通常由細胞核內(nèi)的RNA 多聚酶Ⅱ（Pol Ⅱ）轉(zhuǎn)錄成pri-miRNA，然后由RNase III 內(nèi)切酶Drosha 在核內(nèi)加工成pre-miRNA，并從核內(nèi)導(dǎo)入胞質(zhì)，再經(jīng)RNase III 內(nèi)切酶Dicer 加工成為單鏈mt-miRNA[8,16,17]。mtmiRNA主要有以下特 點[17～20]：（1）分布廣泛和功能多樣。miRNA 廣泛分布于真核細胞內(nèi)，參與多種調(diào)節(jié)途徑，在生物體發(fā)育、器官形成、造血、病毒防御以及細胞的增殖、凋亡和惡變等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。（2）位于基因組非編碼區(qū)。編碼miRNA 的基因可能位于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)、基因間隔區(qū)，或非編碼基因的外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，絕大部分則位于基因間隔區(qū)。70%哺乳動物的miRNA 基因位于TUs 區(qū)，通常長度為18～25 nt。（3）多數(shù)miRNA 以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在。（4）大都具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5’-端有磷酸基，3’-端為羥基，二者可與上游或下游序列不完全配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這一特點使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區(qū)別開來。（5）一些內(nèi)含子miRNA 基因具有高度保守性。體現(xiàn)在基因位置上的保守性和序列上的高度同源性。（6）在表達上具有階段性和組織特異性。在生物發(fā)育的不同階段有不同的miRNA 表達，在不同的組織中表達量也不同。（7）在轉(zhuǎn)錄水平直接對靶基因進行調(diào)控。每個miRNA 可調(diào)控多個靶基因，而某個特定靶基因也可同時被多個miRNAs 調(diào)節(jié)。

RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）是生物體內(nèi)一種廣泛使用的基因表達調(diào)節(jié)機制。上述過程產(chǎn)生的mt-miRNA 被酶切成短的雙鏈配對分子（miRNA/miRNA），隨后其中的一條鏈被裝載在RISC 的核心成分AGO蛋白上形成復(fù)合物RISC，并通過與靶基因mRNA（tg-mRNA）序列的3’-UTR 區(qū)互補配對的方式識別tg-mRNA[8,20]。RISC 對tg-mRNA 的作用取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補的程度，互補配對高時可能進行切割，互補配對低時則起抑制翻譯作用[20]，大致有3種方式：（1）直接切割。即 在miRNA 與tgmRNA 完全互補時，AGO 蛋白可通過此種方式發(fā)揮降解tgmRNA 的作用。（2）抑制翻譯。如果miRNA 與tg-mRNA 不能完全互補，AGO 蛋白則可阻遏tg-mRNA 的翻譯而不影響其穩(wěn)定性。（3）結(jié)合抑制。即具有以上兩種作用模式，導(dǎo)致翻譯活躍的核糖體裂解，或通過未知因子阻遏tg-mRNA 的翻譯。

2.2 miRNAs 在肝纖維化中對TGF-β/Smad 信號通路的調(diào)控作用

越來越多的證據(jù)表明，miRNAs 參與肝纖維化過程，部分調(diào)控TGF-β/Smad 信號通路的成員，已成為調(diào)節(jié)TGFβ信號和肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子，但miRNA 對TGFβ 受體I（TβRI）產(chǎn)生的調(diào)控作用仍不清楚[4,13,21]。目前研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)肝纖維化TGF-β/Smad 信號通路的主要miRNAs 包括miR-19b、miR-33a、miR-200a、miR-146a、miR-17-5p、miR-101、miR-29b、miR-30c、miR-30、miR-193、miR-21、miR-454、miR-155、miR-130a/b、miR-214、miR-let-7、miR-31、miR-133a 和miR-375-3p等。它們可通過調(diào)控TGF-β/Smad 通路中的相關(guān)因子、蛋白或靶基因來影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而調(diào)控HSCs 的增殖、活化與凋亡，進而調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。以下依序?qū)ι鲜鰉iRNAs 的作用進行簡要闡述：

Lakner 等[22]、Zhang 等[23]通過體外培養(yǎng)大鼠靜息和活化的HSCs，發(fā)現(xiàn)激活的HSCs 中miR-19b 顯著減少，同時TβRⅡ顯著上調(diào)；然后將活化的HSCs 中miR-19b 的水平提高，發(fā)現(xiàn)TβRⅡ水平明顯降低，Smad3的mRNA 表達顯著下調(diào)，同時抑制了細胞中α-SMA 和膠原蛋白的表達，說明miR-19b 可通過調(diào)節(jié)TβRⅡ和Smad3的表達水平影響膠原蛋白的表達，即通過降低TβRⅡ和Smad3的表達量來減弱膠原的生成。

Huang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-33a 在肝組織中的表達水平與肝纖維化的進展呈正相關(guān)，HSCs 中miR-33a 的表達明顯高于其他肝纖維化相關(guān)細胞，可能是通過調(diào)節(jié)Smad7表達的潛在機制來調(diào)節(jié)TGF-β的活化，并認為miR-33a 可能是HSCs 活化和肝纖維化進展的新標(biāo)志物。

Sun 等[25]研究發(fā)現(xiàn)miR-200a 在TGF-β1誘導(dǎo)的活化HSC中和體外CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化中的表達均降低，而miR-200a 的過表達顯著抑制HSCs 中α-SMA 的活性。此外，miR-200a 還可通過調(diào)控Wnt/β-catenin 通路來延緩或阻止肝纖維化的發(fā)生。高表達的miR-200a 可通過作用于TGF-β通路來抑制HSCs 的活化和α-SMA 的活性，減少ECM 的生成和沉積，進而抑制肝纖維化的發(fā)生和進展。

He 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1刺激下活化的HSCs 中以及在肝纖維化組織中的miR-146a 表達水平下調(diào)；在提升miR-146a 的表達后，則發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)的HSCs 活化被抑制。經(jīng)分析預(yù)測Smad4是miR-146a 的潛在靶點，miR-146a 通過抑制Smad4的表達參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HSCs 的增殖與活化，進而抑制了肝纖維化的發(fā)展。這些結(jié)果提示miR-146a 靶向作用于Smad4阻斷TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能作為一種新的調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)HSCs 的活化。

Yu 等[27]研究證明，Smad7是miR-17-5p 的直接作用靶點，miR-17-5p 至少部分通過降低Smad7而減弱其在TGF-β/Smad信號通路中的反饋抑制作用，導(dǎo)致HSCs 的增殖和活化，進而使Ⅰ型膠原和α-SMA 的表達增加，由此促進肝纖維化的進程。

Tu 等[13]在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的研究中，觀察到活化的HSCs 和纖維化的肝中miRNA-101顯著下調(diào)，肝纖維化中TβRI 以及它的轉(zhuǎn)錄激活因子Kruppel（KFL6）均出現(xiàn)上調(diào)。隨后提高小鼠HSCs 中miR-101的水平，發(fā)現(xiàn)HSCs 中的TβRI 和KLF6的表達顯著降低，證明TβRI 和KLF6是miRNA-101的直接靶點，miR-101可通過抑制TβRI 以及KLF6的上調(diào)抑制HSCs 中TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而抑制肝纖維化的發(fā)展。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Schisandrin B（五味子乙素）可上調(diào)HSC-T6細胞和CCl4處理大鼠體內(nèi)miR-101-5p 的表達，通過調(diào)節(jié)TGF-β信號途徑來減輕肝纖維化[28]。

Wang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b 與TGF-β介導(dǎo)的纖維化有關(guān)，其表達在人和小鼠的肝組織中及活化的HSCs 中是下調(diào)的，其下調(diào)由Smad3直接介導(dǎo)，同時miR-29b 又可以抑制Smad3的表達。Liang 等[30]也證實miR-29b 與TGF-β1/Smad3信號通路之間相互作用，表明miR-29b 抑制Smad3和TGF-β1介導(dǎo)的肝星狀細胞LX-2的激活，從而抑制肝纖維化。

Roy 等[31]發(fā)現(xiàn)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠和分離培養(yǎng)的HSCs 中miR-30c 和miR-193出現(xiàn)一致下調(diào)；當(dāng)TGF-β作為刺激因子時，miR-30c 和miR-193發(fā)生顯著下調(diào)；之后選擇TGF-β信號通路中的兩個調(diào)控ECM 生成的關(guān)鍵因子Snail-1和TGF-β2分別作為miR-30c 和miR-193的作用靶點進行驗證，發(fā)現(xiàn)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中Snail-1和TGF-β2上調(diào)，且在小鼠的HSCs 中過表達miR-30c 時Snail-1顯著減少，而過表達miR-193時TGF-β2下調(diào)，膠原蛋白的表達降低，這些結(jié)果表明在肝纖維化過程中miR-30c 和miR-193的下調(diào)可能受TGF-β的調(diào)節(jié)，且二者可通過下調(diào)Snail-1和TGF-β2使ECM 的生成減少，進而抑制肝纖維化。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30通過抑制KLF11的表達以減弱HSCs 活化過程中TGF-β/Smad7信號通路的傳導(dǎo)，達到增強Smad7的負反饋調(diào)節(jié)，抑制HSCs 的增殖和遷移，從而抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化的目的[32]。

Noetel 等[33]發(fā)現(xiàn)，miR-21在TGF-β刺激后可下調(diào)Smad7的表達，并通過上調(diào)Smad3而不是Smad2的轉(zhuǎn)錄活性，從而減弱Smad7對TGF-β信號通路的負調(diào)控作用，促進肝纖維化。隨后，Tu 等[34]發(fā)現(xiàn)，小鼠肝細胞中的lincRNA-p21作為TGF-β信號的下游效應(yīng)器，可通過與miR-30相互作用而加強TGF-β信號，并介導(dǎo)其促進肝纖維化的作用。新的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21的過表達通過抑制SPRY2和Smad7的表達，顯著激活ERK 和TGF-β1/Smads 通路[35]。但最新的觀點也認為，miR-21對HSCs的活化和肝纖維化的發(fā)生并不重要[36]。

此外，Zhu 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，miR-454在TGF-β1處理的LX-2細胞中表達下調(diào)，并可通過直接靶向Smad4抑制HSCs 的活化。Csak 等[38]發(fā)現(xiàn)，miR-155可減弱TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad3的表達，從而影響肝纖維化過程。Lu 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可能介導(dǎo)HSCs 細胞培養(yǎng)中miR-130a 和miR-130b 的過度表達、PPARγ的下調(diào)和ECM 基因的過度表達，達到影響肝纖維化的作用。Okada 等[40]認為，miR-214的強誘導(dǎo)作用與慢性乙型或丙型肝炎患者的肝纖維化有關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)EGFR和TGF-β信號通路參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。Matsuura 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，低水平的miR-let-7可能通過激活HSCs 中的TGF-β信號通路影響肝纖維化的發(fā)生。Hu 等[42]發(fā)現(xiàn)，過度表達的miR-31通過增強MMP-2的表達來促進HSC 的活化和遷移，這可能是通過靶向缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）的抑制因子FIH1來實現(xiàn)；同時發(fā)現(xiàn)TGF-β能顯著增加原代大鼠HSCs 中miR-31的表達，且Smad3可通過直接與miR-31的啟動子結(jié)合以刺激miR-31的轉(zhuǎn)錄活性。這些證據(jù)表明，miR-31/FIH1通路可能通過參與HSCs 的TGF-β/Smad3信號傳導(dǎo)而達到調(diào)控肝纖維化的目的。Roderburg 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a 在纖維化過程中的HSCs 內(nèi)明顯下調(diào)，在以TGF-β處理的原發(fā)性小鼠和人的HSCs中miR-133a 的表達顯著下調(diào)，且miR-133a 在原代小鼠HSCs中的過度表達可導(dǎo)致膠原的表達減少。Yang 等[44]最新發(fā)現(xiàn)，在用miR-375-3p 模擬物處理的BRL-3A 細胞和/或原代大鼠肝細胞中，miR-375-3p 的低表達可誘導(dǎo)JAK2/STAT3途徑激活TGF-β1/Smad 信號，從而促進EMT，這與過量攝入果糖導(dǎo)致的肝纖維化相關(guān)。

3 結(jié)語

研究人員為抑制或預(yù)防肝纖維化的發(fā)展付出了努力。阻止HSCs 的活化以及阻礙肝纖維化相關(guān)的信號通路已成為抑制肝纖維化的目標(biāo)。本文闡述了TGF-β/Smad 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)展中的機制，總結(jié)了之前肝纖維化中有關(guān)miRNAs 的研究結(jié)果，歸納了迄今已發(fā)現(xiàn)的大部分相關(guān)miRNAs 對于TGF-β/Smad 信號通路的調(diào)節(jié)機制。不難想象，不久的將來可通過靶向調(diào)控相關(guān)miRNAs 的表達來進行抗纖維化治療。除了可用于治療外，與肝纖維化相關(guān)的miRNAs還可作為疾病診斷和監(jiān)測預(yù)后的標(biāo)志物，而且這些miRNAs也有可能成為針對肝纖維化的有用生物標(biāo)志物或新型治療制劑。