非培養(yǎng)檢測(cè)方法在終末期肝病合并侵襲性真菌感染診斷中的應(yīng)用

金燕琪 章益民,2

1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心、國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心、感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州310003；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院海寧院區(qū)(海寧市人民醫(yī)院)感染病科，浙江嘉興314400

終末期肝?。‥SLD）指各種慢性肝臟損害所致的肝病晚期階段，主要表現(xiàn)為肝功能?chē)?yán)重受損和失代償[1]，包括慢加急性肝衰竭（ACLF）、肝硬化急性失代償（ADLC）、慢性肝衰竭（CLF）和晚期肝細(xì)胞癌。由于抗菌藥物使用頻率高、住院次數(shù)多和使用侵入性治療等因素，ESLD患者侵襲性真菌感染（IFI）已經(jīng)構(gòu)成其治療失敗乃至死亡的重要原因[2-3]。IFI指真菌侵入人體組織、血液，并生長(zhǎng)繁殖引起炎癥反應(yīng)、組織損害乃至器官功能障礙的病理改變過(guò)程，包括深部真菌感染（無(wú)菌部位）及真菌血癥[4]。由于缺乏具體體征和癥狀，真菌培養(yǎng)具有陽(yáng)性率低以及培養(yǎng)周期時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，ESLD合并IFI的早期、精準(zhǔn)的診斷通常具有挑戰(zhàn)性。非培養(yǎng)檢測(cè)方法如直接顯微鏡鏡檢（包括真菌熒光染色）、血清學(xué)檢測(cè)方法及分子生物學(xué)方法已成為ESLD合并IFI具有發(fā)展前景的早期檢測(cè)手段。

一、ESLD合并IFI的流行病學(xué)

根據(jù)多項(xiàng)研究，IFI在ESLD患者中的發(fā)生率約為15%[3，5]，HBV相關(guān)ACLF中的IFI發(fā)病率較高（47.6%）[6]。在ESLD患者中，侵襲性念珠菌病（IC）是主要的IFI，發(fā)生率約為64.1%；其次是侵襲性曲霉?。↖A），發(fā)生率約為35.8%[5]。對(duì)于不同的免疫功能異常，IFI的病原體有所不同[7]，念珠菌往往和患者的黏膜屏障破壞以及真菌的定植密切相關(guān)；曲霉菌往往和細(xì)胞免疫功能異常相關(guān)，尤其是粒細(xì)胞減少或缺乏的患者。ESLD患者往往同時(shí)存在黏膜屏障的異常和粒細(xì)胞減少，因此臨床上IC和IA均常見(jiàn)。ESLD合并IFI最常見(jiàn)的部位是呼吸道和泌尿道，其次是胃腸道、血流、腦部和自發(fā)性真菌性腹膜炎[5-6，8]。3個(gè)月內(nèi)使用抗生素、腎衰竭、糖尿病、更高的終末期肝病模型（MELD）評(píng)分以及腦或呼吸器官衰竭等是IFI發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3，5]。ESLD患者發(fā)生IFI時(shí)表現(xiàn)往往隱匿、不特異。在一項(xiàng)大樣本、多中心的研究中，肝硬化患者發(fā)生IC時(shí)，僅60%患者表現(xiàn)為發(fā)熱[9]。合并IFI的ESLD患者死亡率（57%～77%）顯著高于未合并的患者（14%～20%）[3，5-6，10-13]。

二、IFI的非培養(yǎng)檢測(cè)方法

1.直接顯微鏡鏡檢

樣本直接涂片具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)[14]。歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組（EORTC/MSG）侵襲性真菌病專(zhuān)家指南2020修訂版[以下簡(jiǎn)稱(chēng)“EORTC/MSG指南（2020年版）”][4]提出將通過(guò)針吸或活檢組織獲得的樣本，經(jīng)直接顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)菌絲或黑色酵母樣形態(tài)伴有相關(guān)組織損傷的證據(jù)可作為診斷絲狀真菌的證據(jù)：隱球菌是否有出芽，念珠菌是否有假菌絲或真菌絲作為診斷酵母菌感染的診斷依據(jù)。對(duì)于疑似絲狀真菌感染，樣本推薦使用痰液、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、支氣管刷片或抽吸液，顯微鏡鏡檢下如有真菌成分提示絲狀真菌。有研究通過(guò)顯微鏡直接觀(guān)察IA患者的肺活檢組織，發(fā)現(xiàn)曲霉菌的形態(tài)表現(xiàn)為透明和分隔的雙分枝菌絲，分枝呈45°且寬度均勻[15]。由于樣本直接涂片鏡檢在有菌部位只有發(fā)現(xiàn)大量菌絲才具有診斷意義，并且樣本取材的好壞直接影響結(jié)果，因而陽(yáng)性率很低，不能將真菌鑒定到種的水平[16-17]，因此陰性結(jié)果不能排除感染。

鈣熒光白（CFW）是一種非特異性熒光染色劑，可以和真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)、纖維素和其他含有β-（1，4）-糖苷鍵的碳水化合物緊密結(jié)合[18]。CFW吸收紫外光后發(fā)出明亮的熒光，真菌輪廓和黑暗的背景在熒光顯微鏡下對(duì)比明顯[19]，可以提高IFI陽(yáng)性診斷率。

2.血清學(xué)檢測(cè)方法

（1）（1,3）-β-D葡聚糖檢測(cè)（G試驗(yàn)）

G試驗(yàn)適用于除隱球菌和接合菌（包括毛霉菌和根霉菌等）外所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌[20]。EORTC/MSG指南（2020版）[4]提出在適當(dāng)?shù)呐R床環(huán)境中，包括伴和不伴中性粒細(xì)胞減少的血液系統(tǒng)惡性腫瘤、造血干細(xì)胞移植后中性粒細(xì)胞減少的患者，以及由于胃腸道手術(shù)而反復(fù)發(fā)生吻合口漏，上消化道穿孔的IC風(fēng)險(xiǎn)較高（＞10%）的ICU患者或有臨床懷疑感染的壞死性胰腺炎患者，2次或多次≥80 ng/L的血清G試驗(yàn)水平可用于診斷IFI[21-22]，同時(shí)建議使用Fungitell檢驗(yàn)的單一閾值（＞80 ng/L）。多項(xiàng)血清G試驗(yàn)IFI的檢測(cè)薈萃分析研究中，G試驗(yàn)對(duì)IC的敏感性和特異性分別為65%～85%和75%～85%，對(duì)IA的敏感性和特異性分別為71%～82%和82%～85%[22-23]。在對(duì)IFI檢測(cè)中，G試驗(yàn)靈敏度和特異性都很好，且G試驗(yàn)檢測(cè)樣本采集方便，檢測(cè)時(shí)間短，可作為早期診斷的依據(jù)，但G試驗(yàn)的不足之處在于其不能區(qū)分真菌種屬，不能診斷接合菌和隱球菌。

（2）半乳甘露聚糖（GM）試驗(yàn)

GM是曲霉菌特有的細(xì)胞壁多糖成分，可用于IA的早期診斷[24]。曲霉菌檢測(cè)廣泛使用Bio-Rad曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒（Platelia Aspergillus Ag）[25]。曲霉菌感染時(shí)，GM的釋放量與菌量呈正比，可以反映感染的嚴(yán)重程度，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清GM水平可反映治療的效果。EORTC/MSG指南（2020版）[4]將GM試驗(yàn)作為IA診斷標(biāo)準(zhǔn)的真菌學(xué)證據(jù)之一，即單一血清GM試驗(yàn)（≥1.0）或BALF-GM試驗(yàn)（≥1.0）或血清GM試驗(yàn)（≥0.7）合并BALF-GM試驗(yàn)（≥0.8），腦脊液GM試驗(yàn)（≥1.0）即可作為診斷依據(jù)。根據(jù)多項(xiàng)GM試驗(yàn)在IA診斷中應(yīng)用的研究發(fā)現(xiàn)，GM試驗(yàn)的特異性和敏感性分別為73%～90%和72%～90%[26-27]。

3.分子生物學(xué)方法

（1）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

應(yīng)用PCR技術(shù)可快速、特異地檢測(cè)真菌感染患者各種臨床樣本，如血液、BALF及組織樣本等。EORTC/MSG指南（2020版）[4]提出，PCR具有檢測(cè)曲霉菌種屬的獨(dú)特能力，曲霉菌PCR檢測(cè)是篩選和確認(rèn)可疑IA的檢測(cè)方法。對(duì)于疑似IFI患者，該指南將符合“連續(xù)2次或以上血漿，血清或全血樣本PCR試驗(yàn)陽(yáng)性；BALF樣本2次或多次重復(fù)PCR試驗(yàn)陽(yáng)性；至少1次PCR試驗(yàn)在血液樣本及1次PCR試驗(yàn)在BALF樣本中陽(yáng)性”其中之一條納入確診IA的標(biāo)準(zhǔn)[4]。對(duì)于活檢組織中發(fā)現(xiàn)菌絲陽(yáng)性的患者，指南中推薦PCR結(jié)合DNA測(cè)序擴(kuò)增真菌DNA。此外，已有研究表明PCR能夠直接從臨床樣本中鑒定與三唑抗真菌藥物耐藥相關(guān)的某些突變[28]。因此，PCR檢測(cè)在IFI疑似患者中具有快速、準(zhǔn)確診斷的價(jià)值，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)陰性的樣本具有補(bǔ)充診斷的意義。然而，由于不同實(shí)驗(yàn)室使用的引物、反應(yīng)條件及儀器不同，不同研究PCR診斷IFI的敏感度和特異性相差較大。PCR只能檢測(cè)已知的特定病原體，難以用于未知微生物的檢測(cè)，是診斷IFI的最大障礙。

（2）二代測(cè)序（NGS）

NGS可鑒定出樣本中所含核酸的種類(lèi)，并對(duì)病原體的序列數(shù)、覆蓋度等進(jìn)行定量分析，為疑難危重感染提供精準(zhǔn)快速的診斷依據(jù)。NGS檢測(cè)具有無(wú)偏倚性、覆蓋廣和快速等優(yōu)點(diǎn)，補(bǔ)充了傳統(tǒng)病原學(xué)診斷的不足，有極大的臨床應(yīng)用前景。Shishido等[29]使用游離DNA-NGS技術(shù)檢測(cè)1例中樞神經(jīng)IA肝移植患者的血清樣本，結(jié)果提示曲霉菌陽(yáng)性。在1例疑似IFI的皮肌炎患者診斷中，NGS技術(shù)檢測(cè)BALF提示存在杰氏肺囊蟲(chóng)、煙曲霉菌、米根霉菌3種真菌，且根據(jù)NGS結(jié)果調(diào)整抗真菌治療后患者癥狀得到顯著改善[30]。在一項(xiàng)基于擴(kuò)增子的NGS技術(shù)鑒定真菌染色陽(yáng)性的福爾馬林固定石蠟包埋織病原體的研究中，NGS檢測(cè)44份來(lái)自35例IFI患者的樣本，檢測(cè)到了54種真菌病原體，其中包括40種絲狀真菌，10種酵母菌以及4種雙相真菌，該檢測(cè)結(jié)果與病理結(jié)果完全一致[31]。

三、非培養(yǎng)檢測(cè)方法對(duì)ELSD合并IFI診斷的價(jià)值

1.G試驗(yàn)

一項(xiàng)對(duì)264例ACLF患者的回顧性分析研究中，Verma等[5]首次評(píng)估了G試驗(yàn)在ACLF合并IFI高?；颊咴缙谠\斷中的作用。該研究發(fā)現(xiàn)，在ACLF患者中，G試驗(yàn)（80 ng/L）診斷IFI的靈敏度和特異性分別為97.4%和60.0%。此外，G試驗(yàn)水平及其陽(yáng)性有可能作為ACLF合并IFI高死亡率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此，在ESLD疑似合并IFI的臨床環(huán)境中，G試驗(yàn)?zāi)芴峁┹^高的早期診斷價(jià)值，但同時(shí)亟待更多的研究為其診斷價(jià)值提供充足的臨床證據(jù)。

2.GM試驗(yàn)

Verma等[5]評(píng)估了GM試驗(yàn)在ACLF患者中診斷臨床可疑IFI的價(jià)值，其特異性可達(dá)100%。在一項(xiàng)描述了3例肝硬化急性失代償合并IA的病例系列報(bào)道中，有2例患者呈血清GM陽(yáng)性，而3例BLAF-GM均呈陽(yáng)性[32]。Falcone等[33]描述了2例ESLD合并IA的病例系列報(bào)道，GM試驗(yàn)在痰液中均表現(xiàn)為陽(yáng)性而在血清中均表現(xiàn)為陰性。因此在ESLD患者中，GM試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)IA有較高的診斷特異性。同時(shí)，在IA血清學(xué)證據(jù)尚不足并且能獲得呼吸道樣本的臨床環(huán)境下，呼吸道樣本的GM實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)ESLD患者合并IA有較強(qiáng)的早期診斷價(jià)值。

3.PCR

一項(xiàng)在46例ESLD患者中篩選合并IFI及評(píng)估其危險(xiǎn)因素的研究中，12例患者確診合并IFI，PCR檢測(cè)出13個(gè)樣本（6個(gè)腹水樣本和7個(gè)血液樣本）真菌DNA陽(yáng)性，12例傳統(tǒng)培養(yǎng)陰性的ESLD患者中有3例的PCR結(jié)果為陽(yáng)性[3]。因此，PCR檢測(cè)在ESLD患者疑似合并IFI需要確診時(shí)具有快速、準(zhǔn)確的意義，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)陰性的樣本具有補(bǔ)充診斷價(jià)值。

四、結(jié)語(yǔ)和展望

各種非培養(yǎng)檢測(cè)方法在ESLD合并IFI的診斷中各有優(yōu)點(diǎn)，但也有其局限性，如何將這些方法合理、綜合的應(yīng)用需要進(jìn)一步的研究。在一項(xiàng)涉及125例IFI高危患者的臨床研究中，作者在血清樣本中通過(guò)組合使用曲霉菌PCR及GM試驗(yàn)評(píng)估了非培養(yǎng)檢測(cè)方法在IFI中的診斷價(jià)值[34]，實(shí)現(xiàn)了較高的敏感性（98.2%）和特異性（89.3%），這種思路也可以在ESLD合并IFI的診斷中借鑒。隨著對(duì)病原體早期診斷和精準(zhǔn)診斷要求的提高，亟待更多的以NGS為代表的分子生物學(xué)方法在ESLD合并IFI中的廣泛應(yīng)用。另外，隨著非培養(yǎng)檢測(cè)方法在ESLD合并IFI診斷中的深入應(yīng)用，對(duì)不同年齡、ESLD亞型、真菌類(lèi)型、感染部位IFI數(shù)據(jù)的不斷增加，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)級(jí)別可望獲得顯著提升。期望在不久的將來(lái)，非培養(yǎng)檢測(cè)方法在ESLD合并IFI診斷中的應(yīng)用獲得廣泛共識(shí)，形成清晰的路線(xiàn)圖。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突