關 欣,秦 雯,謝百波,臧新鈺,肖坤,張潔
(1.北京城市學院生物醫(yī)藥學部,北京 100094;2.北京慧寶源生物技術股份有限公司,北京 100000;3.遼寧省撫順市食品檢驗檢測中心,遼寧 撫順 113000)
中藥刺五加葉為五加科植物刺五加葉Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖,具有益氣健脾、補腎安神的功效。刺五加葉中主要含有皂苷、黃酮以及有機酸等類化合物,具有保護心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤、降血糖等藥理作用。研究表明刺五加葉中的多糖具有較強的自由基清除能力,可作為新型天然抗氧化劑進一步開發(fā)利用。葉恒等建立HPLC同時定量刺五加葉中原兒茶酸、綠原酸、刺五加苷E、金絲桃苷及槲皮苷五種主要成分的方法。該方法簡便可靠,適用于刺五加葉中的多成分含量測定。目前,隨著對刺五加成分的不斷探索開發(fā),刺五加作為藥物和保健品的需求逐年增加,但資源逐漸減少,為擴充刺五加藥用資源,經(jīng)查發(fā)現(xiàn)刺五加葉中酚類成分有活性,因此本實驗優(yōu)先研究刺五加葉成分,然而,刺五加葉缺乏統(tǒng)一質量檢測標準,難以全面反映藥材的整體質量。
本文建立刺五加葉一測多評法實現(xiàn)對刺五加葉5種成分的質量控制,即選擇其中使用廣泛的綠原酸,建立其與新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷間的相對校正因子,計算出各成分的含量,為刺五加葉質量控制提供參考依據(jù)。
Agilent 1260型高效液相色譜儀(配紫外光檢測器),真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),超純水機(深圳市宏森環(huán)??萍加邢薰?, SB25-12 DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司),電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。
乙腈為色譜純,純凈水(購自娃哈哈集團有限公司),其他試劑均為分析純,其他如表1、表2。
表1 實驗對照品和實驗試劑
表2 實驗藥材
色譜柱為Agilent Elipse Plus C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm,5μm);流動性為0.3%磷酸水(A)-乙腈溶液(B)梯度洗脫,0~3 min, 95%→95%A;3~40 min, 95%→80%A;40~55 min, 80%→70%A;55~60 min,70%→10%A;體積流量1.0 mL/min;檢測波長360 nm;柱溫30℃。
1.供試品溶液的制備。將刺五加葉干燥后粉碎,精確稱取刺五加葉粉末1.0 g,精密加入70%甲醇水10 mL,超聲提取40 min,用70%甲醇水補足失重,0.45 μm濾膜濾過,作為供試品溶液。
2.對照品溶液的制備。精密稱取各對照品適量,加甲醇溶解定容配制成每1 mL含綠原酸0.951 mg、隱綠原酸0.502 mg、新綠原酸0.63 mg、槲皮苷1.12 mg、金絲桃苷1.162 mg的溶液,作為對照品溶液。
3.方法學考察
(1)專屬性試驗。取供試品溶液,采用上述色譜條件進樣分析,觀察圖譜,比較各對照品保留時間,結果表明該方法專屬性良好,見圖1和圖2。
(2)線性關系試驗。精密稱取各對照品綠原酸9.51 mg、新綠原酸6.3 mg、隱綠原酸5.02 mg、金絲桃苷11.62 mg、槲皮苷1.12 mg,置于10 mL量瓶,用甲醇定容至刻度線,搖勻,配成各對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液適量,加甲醇稀釋成系列對照品溶液,新綠原酸為0.2,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005 mg/L,綠原酸為0.95,0.8,0.4,0.2,0.1,0.05 mg/L,隱綠原酸為0.2,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005mg/L,金絲桃苷為0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025(mg/L),槲皮苷為0.08,0.04,0.02,0.01,0.005,0.0025 (mg/L)。按照2.1色譜條件進行測定,計算得到各對照品線性回歸方程,表明在濃度范圍內線性關系良好,考察結果見表3。
圖1 刺五加葉供試品高效液相色譜圖
圖2 混標對照品溶液高效液相色譜圖
表3 對照品線性范圍及線性回歸方程
(3)精密度試驗。取上述混合對照品溶液,在上述色譜條件下進樣6次,每次進樣10 μL,測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷峰面積的RSD值分別為0.24%、0.03%、0.44%、0.05%、0.16%,結果表明儀器具有良好的精密度。
(4)穩(wěn)定性試驗。將上述供試品溶液放于室溫下0、2、4、8、12、24 h,根據(jù)上述色譜條件檢測其峰面積,考察24 h內供試品溶液的穩(wěn)定性。24 h內5種成分峰面積的RSD值分別為新綠原酸2.35%、綠原酸0.72%、隱綠原酸2.06%、金絲桃苷0.58%、槲皮苷0.52%(n=6),表明試驗溶液在本實驗條件下具有良好的穩(wěn)定性。
(5)重復性試驗。制備6份供試品溶液進樣分析,得到各成分的峰面積,計算得到5種目標成分的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷和槲皮苷峰面積的RSD值分別為1.77%、2.02%、2.78%、1.75%、1.30%,結果表明該實驗重現(xiàn)性良好。
(6)加樣回收率試驗。按上述方法制備9份供試品溶液,分別加入樣品中5種成分質量的低(80%)、中(100%)、高(120%)濃度已知對照品,根據(jù)上述色譜條件進行分析,計算加樣回收率及RSD值。結果表明,加入的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷5種成分質量的平均回收率,在低濃度時分別為95.3%、96.2%、97.7%、97.9%、95.8%,RSD值分別為0.8%、1.4%、3.8%、0.5%、1.6%;在中濃度時分別為95.0%、95.6%、103.6%、103.5%、104.6%,RSD值分別為2.5%、2.7%、3.0%、1.7%、1.9%;在高濃度時分別為96.3%、97.9%、96.8%、95.6%、95.4%,RSD值分別為1.3%、5.3%、3.7%、2.3%、0.9%。
(7)定量下限、檢測下限。用50%甲醇水稀釋混合對照品,根據(jù)上述色譜條件重復進樣檢測6次,實驗結果表明在最低定量限檢測中,當新綠原酸濃度為0.004mg/mL時信噪比為9.91,當綠原酸濃度為0.004mg/mL時信噪比為12.35,當隱綠原酸濃度為0.004mg/mL時信噪比為9.62,當金絲桃苷濃度為0.008mg/mL時信噪比為6.23,當槲皮苷濃度為0.015mg/mL時信噪比為11.82。在最低檢測限檢測中,當新綠原酸濃度為0.0008mg/mL時信噪比為3.40,當綠原酸濃度為0.0008mg/mL時信噪比為2.21,當隱綠原酸濃度為0.0008mg/mL時信噪比為3.12,當金絲桃苷濃度為0.0003mg/mL時信噪比為2.87,當槲皮苷濃度為0.0005mg/mL時信噪比為3.60。
4.相對校正因子的確定。根據(jù)上述方法制備6份混合對照品溶液,并根據(jù)上述色譜條件確定5種成分的峰面積。使用綠原酸作為內參物,計算新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷槲皮苷的相對校正因子分別為0.906、0.899、3.136、2.645。
5.一測多評法與外標法結果比較。制備6份供試品溶液,按上述色譜條件測定,用兩種方法計算各成分的含量,結果見表4。其中,編號1~6批刺五加葉產(chǎn)地依次為遼寧省新賓(刺五加葉)、遼寧省清原(刺五加葉)、黑龍江省雞西(刺五加老粗葉)、黑龍江省雞西(刺五加嫩葉)、黑龍江省雞西(刺五加葉1)、黑龍江省雞西(刺五加葉2)。分析結果認為2種含量測定方法得到的含量之間無顯著性差異,說明一測多評法用于刺五加葉中多種酚類成分的含量測定中可行。
表4 外標法和一測多評法測定刺五加葉中5種成分含量(mg/g)
實驗嘗試不同的檢測波長,發(fā)現(xiàn)在360 nm檢測波長下,測定成分的分離度良好,峰形較好,雜質峰較少,確保方法的準確度較高。
實驗嘗試甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水提取刺五加葉。結果發(fā)現(xiàn)使用70%甲醇水超聲提取刺五加葉時,目標成分提取率較高,分離度較好,雜質峰較少。而且具有易操作、節(jié)省時間、成本的特點,實驗建立一測多評法測定刺五加葉中五種酚類成分的含量,為刺五加葉的質量評價和質量控制提供參考。