微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

沙月霞 王晨曦 邢敏 王佳娟 李明洋 沈瑞清

摘要 為明確微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌的總DNA提取后，采用微生物多樣性測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行了序列測(cè)定，分析了2種微生物菌劑拌土后玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)特征。微生物菌劑M1和M2拌土增加玉米農(nóng)田土壤中全磷、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀的含量;對(duì)玉米土壤細(xì)菌群落多樣性有一定程度的影響，豐富度增加，多樣性和均勻度降低，檢測(cè)樣本序列數(shù)量和細(xì)菌群落的OTU （operational taxonomic units）數(shù)量顯著增加;對(duì)土壤細(xì)菌群落組成有影響，變形菌門（Proteobacteria）的豐度下降，放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加，優(yōu)勢(shì)菌屬放線菌和芽孢桿菌的豐度增加;降低了土壤中引起人類疾病、參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化的微生物豐度，增加了參與代謝通路的微生物豐度。微生物菌劑拌土?xí)绊懹衩邹r(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成，改善土壤營(yíng)養(yǎng)，增加有益微生物的豐度，進(jìn)而改善玉米農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。

關(guān)鍵詞 多樣性;土壤細(xì)菌群落;微生物菌劑;高通量測(cè)序;微生物生態(tài)學(xué)

中圖分類號(hào) S 154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0138-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.039

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effect of Clay Treated by Microbial Agents on Soil Bacterial Community Diversity of Maize Field

SHA Yue-xia1，WANG Chen-xi2，XING Min1 et al

（1. Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan，Ningxia 750011;2. School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750004）

Abstract To understand the microbial diversity of soil bacterial community of maize field treated by microbial agents on clay.High-throughput sequencing technology was adopted to study the microbial community structure and composition of soil bacteria in maize field.DNA of the microbial community of soil bacteria in the maize field was extracted. The bacterial 16S rRNA gene hypervariable region V5-V7 was detected by high-through sequenceing technologies.The contents of soil physicochemical indexes including total phosphorus，nitrate nitrogen，available phosphorus，rapidly available potassium was increased after maize field treated by microbial M1 and M2 on clay，respectively.In addition，the soil bacterial community diversity of maize field was influenced in some random，richness index was higher，diverse and evenness index were lower，and sequence and operational taxonomic units number of samples were increased. The abundance of Proteobacteria was reduced，and the abundance of Actinobacteria and Firmicutes were increased. Whats more，the abundance of the dominant bacteria genus containing Actinomycetes and Bacillus were improved evidently. The abundance of soil bacteria which could cause human disease and participate cell transformation was reduced，and that of soil bacteria participating metabolic pathway was higher. The soil bacterial community diversity and structure could be influenced after maize field treated by microbial agents on clay，in addition to enhance soil nutrition，increase abundance of beneficial microorganism，and then improve the ecological environment of maize field.

Key words Diversity;Soil bacterial community;Microbial agent;High-throughput sequencing technology;Microbial ecology

土壤微生物參與土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，是土壤有機(jī)物質(zhì)的重要分解者和對(duì)農(nóng)田土壤生態(tài)環(huán)境至關(guān)重要的生物活性因子，對(duì)環(huán)境影響非常敏感[1]。土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是衡量和評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一[2-3]。土壤微生物群落多樣性、豐富度與均勻度可以保證土壤生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性，提高土壤抵抗環(huán)境惡化的緩沖能力[4-5]。開(kāi)展黃河灌區(qū)土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)研究，對(duì)于實(shí)現(xiàn)黃河流域生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展具有重要的生態(tài)意義。

玉米是重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料，由于種植模式、氣候變化、化學(xué)肥料與農(nóng)藥、土壤鹽漬化以及干旱等因素的影響，玉米農(nóng)田土壤中病原菌的數(shù)量日積月累，土傳病害的危害日益加重[6-7]。土壤微生物中病原菌的數(shù)量和活性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)藝措施或者生物制劑的投入響應(yīng)敏感[8-9]。微生物菌劑施用能夠改善土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況，提高土壤養(yǎng)分，還可以調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性[10]。Chen等[11]采用棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）顆粒劑在播種前與化肥混合施入土壤，對(duì)玉米莖腐病防效顯著。

馮帥[12]研究發(fā)現(xiàn)接種施氏假單孢菌（Pseudomonas stutzeri）A1501 能夠顯著影響玉米根際土壤細(xì)菌群落和固氮菌群落結(jié)構(gòu)。程揚(yáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)土壤中施加 5 t/hm2的秸稈生物炭對(duì)玉米根際和非根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能影響顯著，主要影響微生物群落代謝、遺傳和信息傳遞等過(guò)程。已有的研究主要集中于木霉菌、假單孢菌等對(duì)玉米田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，芽孢桿菌為功能菌的復(fù)合微生物菌劑對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的研究較少。該研究不僅探索了芽孢桿菌為功能菌的復(fù)合微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，還探索了復(fù)合微生物菌劑對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)的改善效果。筆者采用高通量測(cè)序技術(shù)，研究微生物菌劑拌土對(duì)寧夏玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落的物種組成、群落多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步探討土傳病害的防控與農(nóng)田土壤的微生態(tài)功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)是寧夏回族自治區(qū)石嘴山市惠農(nóng)區(qū)廟臺(tái)鄉(xiāng)（106.70° E，39.20° N）。土壤類型為潮土，地下水位較高，鹽堿較重，有機(jī)質(zhì)平均含量為（16.70±3.77） g/kg，有效磷平均含量為（26.70±17.30） mg/kg，速效鉀平均含量為（199.90±66.87） mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

①微生物菌劑M1，包括枯草芽孢桿菌（B. subtilis）HR15、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）HR37和貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）HR55按照1∶1∶1比例的混合發(fā)酵液15 L、腐殖酸2.75 kg、硫酸鈣160 g[14]、硫酸鋅80 g[15]、硫酸亞鐵80 g、硫酸鉀80 g[16]，載體分別為羊糞30 kg。②微生物菌劑M2，將M1的載體更換為雞糞有機(jī)肥（包含有機(jī)碳25.5%、氮1.63%、磷1.54%、鉀0.85%）約30 kg。③微生物菌劑對(duì)照MCK，其功能菌是枯草芽孢桿菌和酵素菌BYM（由細(xì)菌、放線菌和真菌三大類30多種有益菌和生物酶組成的功能團(tuán)），枯草芽孢桿菌≥1億個(gè)芽孢/g，酵菌素≥5億/g，由雷邦斯生物技術(shù)（北京）有限公司，載體是水溶性腐殖酸≥55%。④化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照是20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉，由深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)。玉米品種是濟(jì)玉901號(hào)。

1.3 微生物菌劑田間拌土的方法

2019年4月11日在寧夏回族自治區(qū)惠農(nóng)區(qū)廟臺(tái)鄉(xiāng)東永固村種植玉米（未用過(guò)種衣劑），種植前將微生物菌劑M1、M2、微生物對(duì)照藥劑（MCK）均勻撒施在農(nóng)田土壤表面，施用量為600 kg/hm2，20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉混合液（ES）均勻噴施到土壤表面，所有試驗(yàn)小區(qū)均使用旋耕機(jī)旋耕，旋耕深度為20 cm左右。田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)處理：CK是空白對(duì)照;M1是載體為羊糞的微生物菌劑M1;M2是載體為雞糞有機(jī)肥的微生物菌劑M2;ES是化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照[20%噁霉靈可濕性粉劑+生根粉（4～6 g/m2）];MCK是微生物菌劑對(duì)照。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)面積是200 m2，小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)之間用田埂分隔，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間不施用其他殺菌劑，正常進(jìn)行殺蟲(chóng)劑、農(nóng)藝措施和水肥管理。

1.4 微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤理化性質(zhì)的影響

玉米乳熟期（7月22日）采用取土器（直徑為6 cm，長(zhǎng)度為20 cm）采集農(nóng)田土壤（距離植株15 cm，深度為0～20 cm），土壤樣本采用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分土壤樣品送上海美吉桑格生物醫(yī)藥有限公司檢測(cè)土壤微生物群落多樣性，另一部分土壤樣本檢測(cè)土壤pH、有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀等理化指標(biāo)。

土壤樣品基本理化參數(shù)（全氮、全磷、pH 等） 采用常規(guī)方法測(cè)定：土壤pH采用ZLJC/YQ-025型pH計(jì)測(cè)定，全氮采用凱氏定氮法測(cè)定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比法測(cè)定，全磷采用堿熔法測(cè)定，速效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測(cè)定，土壤硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測(cè)定。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.5 基因組DNA抽提 提取各個(gè)處理的土壤樣本基因組總DNA，然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。

1.6 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌擴(kuò)增引物為338F：5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)合成，測(cè)序區(qū)域合成帶有barcode的特異引物。PCR正式試驗(yàn)采用20 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，5.0 μmol/L正向引物0.8 μL，5.0 μmol/L反向引物0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA10 ng，補(bǔ)ddH 2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min;循環(huán)數(shù)×（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s）;72 ℃ 10 min，10 ℃直到反應(yīng)結(jié)束。第一輪擴(kuò)增引物：799F-1392R 27cycles，退火55 ℃。第二輪擴(kuò)增引物：799F-1193R 13 cycles，退火55 ℃。

對(duì)第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后進(jìn)行相應(yīng)比例的混合?；旌虾蟮漠a(chǎn)物用Illumina公司的Miseq 2×300平臺(tái)測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和軟件拼接，過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列。將有效序列相似性≥97%序列聚類成為分類單元 （operational taxonomic units）。運(yùn)用R軟件進(jìn)行OUT分類等級(jí)的相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)，再用QIIME軟件進(jìn)行單樣品組成分析，計(jì)算樣品的Coverage、Chao、Shannon指數(shù)等[14-16]。Shannoneven值數(shù)值越大，說(shuō)明群落均勻度越低。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。Coverage是覆蓋度指數(shù)，表征微生物樣本序列的檢測(cè)概率，數(shù)值越高表明檢測(cè)出的序列概率越高，能夠反映樣本中微生物的真實(shí)情況。Chao為豐富度指數(shù)，數(shù)值越大豐富度越高。利用QIIME和和Ggplot 2 軟件進(jìn)行PCoA分析，ANOSIM中的statistic（R=-1～+1）越接近于1表示各處理組之間的差異大于組內(nèi)的差異，如果R值比較小表示處理組之間和組內(nèi)沒(méi)有差異。P值如果小于0.05，說(shuō)明檢測(cè)值的可信度較高。通過(guò)Tax4Fun軟件對(duì)16S RNA基因序列進(jìn)行基于Silva數(shù)據(jù)庫(kù)的KEGG功能注釋。

統(tǒng)計(jì)分析采用DPS 17.10軟件，顯著性分析采用單因素方差分析中的最小極差法（least significant ranges，LSD）（P≤0.05），數(shù)值為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤理化性質(zhì)的影響

微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤理化性質(zhì)的影響見(jiàn)表1。由表1可知，與空白對(duì)照相比，4組處理均可以增加土壤中有機(jī)碳和有機(jī)質(zhì)含量，對(duì)玉米農(nóng)田土壤其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)影響趨勢(shì)不一致。微生物菌劑M2可以增加土壤中全氮、全磷、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀的含量，微生物菌劑M1增加土壤中全磷、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀的含量，噁霉靈可濕性粉劑ES處理組降低土壤中硝態(tài)氮、全氮和速效鉀的含量，增加全磷和有效磷含量。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2021年

2.2 檢測(cè)樣本序列統(tǒng)計(jì) 對(duì)5個(gè)處理的15個(gè)樣本進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序分析，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)拼接和過(guò)濾后得到797 948條優(yōu)質(zhì)序列。不同拌土處理獲得不同的序列數(shù)量，M2（59 237）>MCK（54 503）>M1（53 611）>CK（50 464）>ES（48 168）。一般將相似水平在97%的序列進(jìn)行OTU聚類，統(tǒng)計(jì)所有樣本OTUs的豐度信息。檢測(cè)樣本優(yōu)質(zhì)序列的長(zhǎng)度主要分布在401～440 bp，其中在401～420 bp序列數(shù)量最多為465 960條（圖1）。

2.3 玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落的共有和獨(dú)有OTU

Venn圖一般可以比較不同檢測(cè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目。圖2顯示，5個(gè)處理樣本中的OTU數(shù)量不同，MCK（4 695）>M1（4 653）>M2（4 396）>ES（4 238）>CK（4 351）。不同處理組的土壤細(xì)菌群落中既有共有OTU物種，也有獨(dú)有的OTU。5個(gè)處理相同的OTU有2 701個(gè)，M1處理組獨(dú)有的OTU數(shù)量為266個(gè)，M2處理組獨(dú)有OTU數(shù)量為209個(gè)，MCK處理組獨(dú)有OTU數(shù)量為412個(gè)，CK處理組獨(dú)有OTU數(shù)量為208個(gè)，ES處理組獨(dú)有OTU數(shù)量為166個(gè)。除共有和獨(dú)有OTU外，各處理之間有相同或相似的OTU。

2.4 豐度等級(jí)曲線

Rank-Abundance曲線用以分析細(xì)菌群落的物種豐富度和均勻度，曲線的寬度反映了物種的豐富度，寬度范圍越大，豐富度就越高;曲線的形狀反映了群落均勻度，曲線越平緩，均勻度越高;曲線的下降趨勢(shì)反映了物種的多樣性，下降趨勢(shì)越平滑則物種多樣性越高，下降趨勢(shì)快速陡然表明物種的多樣性較低，群落中的優(yōu)勢(shì)菌群所占比例較高。

圖3顯示，微生物菌劑M1和M2樣本的曲線跨度最大，且重合多，其他樣本的曲線跨度較小，說(shuō)明M1和M2樣本的豐富度最高，而噁霉靈可濕性粉劑、微生物菌劑對(duì)照和空白對(duì)照樣本的豐富度較低。5組樣本的曲線形狀平緩、下降緩慢，表明5組處理的群落多樣性和均勻度都較高，其中空白對(duì)照CK的曲線下降相對(duì)劇烈，說(shuō)明空白對(duì)照的群落多樣性和均勻度低于其他樣本。豐度等級(jí)曲線說(shuō)明微生物菌劑拌土對(duì)土壤細(xì)菌群落的豐富度、多樣性和均勻度有影響。

2.5 微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

2.5.1 Alpha多樣性。采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了分析，明確微生物菌劑拌土對(duì)玉米田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性的影響見(jiàn)表2。由表2可知，檢測(cè)樣本的覆蓋度均達(dá)98%以上，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果基本反映了土壤樣本中細(xì)菌群落多樣性信息。各處理的土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)有一定差異（P<0.05），M1>M2>CK≈MCK≈ES。微生物菌劑拌土后降低了土壤細(xì)菌群落多樣性，各處理之間有一定差異（P<0.05），CK>M1≈MCK≈ES>M2。微生物菌劑拌土對(duì)土壤細(xì)菌均勻度有一定影響（P<0.05），CK≈ES≈MCK>M1>M2。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性具有一定程度的影響。

2.5.2 Beta多樣性。采用主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA分析）比較不同處理微生物群落差異。土壤細(xì)菌群落PCoA（圖4）的前2個(gè)主坐標(biāo)軸解釋了41.99%的群落差異，其中軸Ⅰ和軸Ⅱ分別是27.62%和14.37%，微生物菌劑對(duì)照MCK和M2分布在不同象限，與空白對(duì)照CK相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明微生物對(duì)照菌劑和M2拌土?xí)淖兺寥兰?xì)菌群落結(jié)構(gòu)。微生物菌劑M1、噁霉靈可濕性粉劑（ES）處理組和空白對(duì)照的土壤細(xì)菌群落距離較近，說(shuō)明這2組處理對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落多樣性有一定程度的影響，但還可能存在其他影響因素。樣本分組相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）結(jié)果顯示，5組樣本之間的R值只有0.262 2，說(shuō)明處理組間差異與組內(nèi)差異之間沒(méi)有差異（P>0.05）。P值為0.015說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果可信度比較高，能夠顯示組間和組內(nèi)的差異。

2.6 微生物菌劑拌土對(duì)玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

2.6.1 門水平上的群落構(gòu)成。圖5顯示玉米農(nóng)田土壤中的細(xì)菌門主要包含變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chioroflexi）、 酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）。拌土處理組樣本的放線菌門、酸桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度高于空白對(duì)照，其中微生物菌劑M1和M2的放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的豐度最高?？瞻讓?duì)照樣本的變形菌門和芽單孢菌門相對(duì)豐度高于其他樣本，噁霉靈可濕性粉劑拌土的樣本中變形菌門的豐度最低，酸桿菌門的豐度最高。說(shuō)明微生物菌劑拌土?xí)绊懹衩邹r(nóng)田土壤細(xì)菌門水平上的群落組成。

2.6.2 屬水平上的群落構(gòu)成。樣本測(cè)序結(jié)果中不能分類的細(xì)菌屬比例較大，圖6顯示玉米農(nóng)田土壤中可以分類的相對(duì)豐度>1.0%的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要包括鞘氨醇單孢菌屬（Sphingomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、大理石雕菌屬（Marmoricola）、Gaiella和芽孢桿菌屬，其中節(jié)桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬和Gaiella都屬于放線菌門，鞘氨醇單孢菌屬于變形菌門，芽孢桿菌屬于厚壁菌門?？瞻讓?duì)照樣本的Gaiella豐度高于其他處理，但節(jié)桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度低于其他樣本。微生物菌劑M1和M2拌土處理的樣本中節(jié)桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬、Gaiella和芽孢桿菌屬

的豐度高于其他樣本，M2樣本的鞘氨醇單孢菌屬豐度最高。噁霉靈可濕性粉劑樣本的鞘氨醇單孢菌屬豐度最低，節(jié)桿菌屬、類諾卡氏菌屬、大理石雕菌屬、Gaiella和芽孢桿菌屬的豐度低于M1和M2，但高于空白對(duì)照和MCK。說(shuō)明微生物菌劑拌土?xí)绊懹衩邹r(nóng)田土壤細(xì)菌屬水平上的群落構(gòu)成。

2.7 玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落的Tax4Fun功能預(yù)測(cè)

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of genes and genomes）用于系統(tǒng)分析檢測(cè)樣本的基因組信息和功能信息。表3表明，微生物菌劑拌土后，玉米農(nóng)田土壤中參與各種代謝通路、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、環(huán)境信息、有機(jī)系統(tǒng)以及引起人類疾病的微生物豐度發(fā)生了變化，但土壤中參與基因信息的微生物豐度沒(méi)有變化。微生物菌劑M1和M2拌土降低了土壤中引起人類疾病、細(xì)胞轉(zhuǎn)化的微生物豐度，提高了土壤中參與代謝通路的微生物豐度。Tax4Fun結(jié)果說(shuō)明微生物菌劑拌土?xí)绊懹衩邹r(nóng)田土壤微生物群落的基礎(chǔ)生命功能，從而改善了土壤的生態(tài)功能。

3 結(jié)論與討論

土壤微生物具有重要的生態(tài)功能，參與土壤中有機(jī)質(zhì)的分解和腐殖質(zhì)的合成，促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)，提高土壤肥力[17]。土壤微生物的生物活性容易受到土壤理化性質(zhì)、種植模式、植物種類等因素的影響[18-19]。土壤微生物群落的多樣性反映了土壤生態(tài)機(jī)制和逆境脅迫對(duì)微生物群落的影響，在一定程度上可用作土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和土壤質(zhì)量健康的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。目前，有關(guān)芽孢桿菌為功能菌的復(fù)合微生物菌劑拌土對(duì)黃河流域的玉米農(nóng)田土壤微生物群落組成及其多樣性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物菌劑拌土后玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落及其多樣性進(jìn)行了研究。微生物多樣性測(cè)序技術(shù)具有高通量、操作簡(jiǎn)便、快速、數(shù)據(jù)精確、成本低等特點(diǎn)。筆者采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物菌劑M1和M2拌土對(duì)寧夏玉米土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)特征的影響進(jìn)行了研究，得出了噁霉靈可濕性粉劑、微生物菌劑對(duì)照、微生物菌劑M1和M2對(duì)玉米品種濟(jì)玉901土壤細(xì)菌群落豐富度、多樣性和均勻度以及所屬的門分類水平上的相對(duì)豐度。測(cè)序結(jié)果表明，檢測(cè)樣本的細(xì)菌群落在目、科和屬水平上仍有較大比例的微生物不能明確分類，但在門水平上獲得比較明確的分類名稱信息。估計(jì)與測(cè)序序列長(zhǎng)度、測(cè)序區(qū)間、比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)以及16S rRNA基因本身的局限性等有關(guān)。

土壤pH與細(xì)菌群落多樣性具有顯著負(fù)相關(guān)性[18]，該研究證實(shí)微生物菌劑拌土處理組的土壤pH明顯降低，但土壤細(xì)菌群落多樣性明顯增加。細(xì)菌喜歡生活在營(yíng)養(yǎng)豐富、有機(jī)質(zhì)易于分解的土壤環(huán)境中[20]。芽孢桿菌可以將土壤中植物難以吸收的營(yíng)養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化為易吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善土壤的生態(tài)環(huán)境。該研究的2種復(fù)合微生物菌劑的功能菌是3種土壤來(lái)源的芽孢桿菌，拌土處理可以顯著增加土壤中有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀的含量，為土壤細(xì)菌的繁殖提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，增加了細(xì)菌群落的物種豐富度和均勻度，提高了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此，評(píng)價(jià)微生物菌劑對(duì)土壤微生物群落的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

土壤細(xì)菌群落在門水平上的組成主要包括變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等，外源投入物對(duì)土壤細(xì)菌門的豐度影響顯著。微生物菌劑M1和M2拌土后，玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落的變形菌門豐度下降，放線菌門的豐度增加，這與Chen等[11]、馮帥[12]、呂寧等[19]的研究結(jié)果較為一致。關(guān)于細(xì)菌屬水平的組成影響，該研究結(jié)果與前人的研究差異較大。采用微生物菌劑M1和M2拌土后，玉米農(nóng)田土壤細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要是放線菌屬和芽孢桿菌屬，顯著增加了土壤中有益微生物的豐度。土壤中病原菌的數(shù)量及其生物學(xué)活性的增加會(huì)破壞土壤微生物群落的穩(wěn)定性與和諧性，從而危害地上部植物的正常生長(zhǎng)[6-7] 。放線菌和芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)和植物激素，可以抑制土壤中有害微生物的數(shù)量和危害，促進(jìn)地上部植物生長(zhǎng)，進(jìn)而增強(qiáng)了土壤的生態(tài)服務(wù)功能[21]。

微生物群落多樣性是否穩(wěn)定會(huì)直接影響微生物的生態(tài)功能和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。該研究中的微生物菌劑拌土后，參與各種代謝的微生物豐度明顯增加，土壤中引起人類疾病的微生物豐度明顯降低;惡霉靈可濕性粉劑處理后的玉米土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，土壤中引起人類疾病的微生物豐度增加。研究結(jié)果證實(shí)微生物菌劑拌土可以改變土壤微生物基本生命活性功能和代謝途徑，從而改善土壤微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境的調(diào)控效應(yīng)，增強(qiáng)土壤的生態(tài)功能。

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