蟲草黃酮類化合物的生物活性及提取技術(shù)研究進展

齊楠 王思強 張彪 佘新松

摘要 黃酮類化合物如染料木黃酮、大豆苷元等，是蟲草的主要活性成分，具有多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化及清除自由基作用等。重點評述蟲草黃酮類化合物的生物活性以及在提取黃酮類化合物方面的最新進展，分析該類資源在深度開發(fā)過程中出現(xiàn)的問題并予以展望，以期進一步擴大蟲草黃酮類化合物在功能性食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用市場。

關(guān)鍵詞 蟲草;黃酮類化合物;生物活性;提取技術(shù)

中圖分類號 R284.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）05-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Research Progress on Biological Activity and Extraction Technology of Flavonoids from Cordyceps

QI Nan，WANG Si-qiang，ZHANG Biao et al

（College of Life and Environment Science，Huangshan University，Huangshan，Anhui 245041）

Abstract Flavonoids，such as genistein and daidzein，are the main active components of Cordyceps with a variety of biological activities，such as immune regulation，anti-tumor，anti-virus，anti-inflammation，anti-oxidation and free radical scavenging effects，etc.This paper focused on the biological activity of Cordyceps flavonoids and the latest progress in the extraction of flavonoids，analyzed the problems in the process of deep exploitation of this kind of resource and looked forward to the future in order to further expand the application market of Cordyceps flavonoids in the field of functional food and biomedicine.

Key words Cordyceps;Flavonoids;Biological activity;Extraction technology

黃酮類化合物（flavonoids）又稱為類黃酮，不是指某一種化合物，而是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似、具有相同活性的某一類物質(zhì)。黃酮類化合物是自然界中分布最廣泛的天然活性成分之一，存在于蔬菜、水果、花卉、樹皮、根、莖和葉子中，特別在某些藥用植物當(dāng)中含量極其豐富[1-2]。黃酮類化合物作為一種活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用[3-4]，還可以調(diào)節(jié)血糖、血脂和血壓[5-6]。目前，盡管化學(xué)合成方法發(fā)展迅速，但大多數(shù)黃酮類化合物仍然來源于天然植物原料中[7]，易受季節(jié)的影響，且相對而言，從植物中提取的黃酮類有效成分含量較低，造成市場上黃酮類相關(guān)產(chǎn)品的價格上漲。因此，從蟲草屬真菌中提取黃酮類物質(zhì)已成為一種極具前景的生產(chǎn)方式。

蟲草是一類珍貴的昆蟲病原真菌，在真菌和昆蟲漫長的協(xié)同演變過程中，產(chǎn)生了大量的功能性成分，如核苷、固醇、多糖、蟲草酸、氨基酸、多肽等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，蟲草具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗菌、抗輻射、抗炎，抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗細胞凋亡、治療糖尿病、止痛和抗過敏等[8-17]。

近年來，國內(nèi)外對蟲草的研究側(cè)重于蟲草素、蛋白質(zhì)、蟲草多糖、多肽、微量元素、甘露醇、蟲草酸、腺苷、色素、核苷等常見成分的提取和相關(guān)藥理作用的研究，而對于蟲草黃酮類化合物的相關(guān)研究相對較少，欠缺系統(tǒng)性的整理及歸納。為更好地研究和開發(fā)、利用蟲草資源，筆者擬對蟲草黃酮類化合物的生物活性及其提取進行系統(tǒng)整理與概括，對該類資源研發(fā)過程中存在的問題進行分析并予以展望，為進一步開發(fā)和利用蟲草黃酮類化合物提供新思路。

1 蟲草中黃酮類化合物

黃酮類化合物最初指的是一類基于2-苯基色原酮的化合物，目前，它指的是一系列通過中央三碳結(jié)構(gòu)與含有酚羥基的苯環(huán)相連的化合物[18]。黃酮類化合物主要包括染料木黃酮、大豆苷元等，已從蟲草中分離出的黃酮類化合物有4種新型異黃酮甲基糖苷：大豆苷元7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯、黃豆黃素7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯（glycitein-7-O-β-d-glucoside-4″-O-methylate，CGLM）、染料木黃酮7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯和染料木黃酮4′-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯[19]，以及4′-羥基異黃酮-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷（4″-甲氧基大豆苷）、5，4′-大豆黃素-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷[20]和6，7，2′，4′，5′-五甲氧基黃酮[21]。

2 蟲草黃酮的生物活性

相關(guān)研究表明，蟲草黃酮具有多種生物活性。近年來，對蟲草黃酮的活性研究多集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、抑菌作用和鎮(zhèn)靜、催眠作用（圖1）。

2.1 免疫調(diào)節(jié)

蟲草黃酮可以通過控制慢反應(yīng)致炎物質(zhì)的釋放而發(fā)揮免疫活性。Oh等[22]研究表明蛹蟲草乙酸乙酯提取物對抗原引起的RBL-2H3細胞脫顆粒和被動皮膚過敏應(yīng)答具有強烈的抑制作用，其反應(yīng)機理是抑制Syk、ERK、p38和JNK等蛋白的磷酸化表達。Park等[23]隨后證實，蛹蟲草乙酸乙酯提取物中所含的染料木黃酮及其甲基糖苷類衍生物抑制脫顆粒的作用最強，可減少受抗原刺激的RBL-2H3細胞釋放IL-4和TNF-α，下調(diào)Lyn、Syk、PLCγ1和LAT蛋白的活化水平，并抑制AKT和ERK1/2蛋白的激活。因此，蟲草黃酮可作為過敏性疾病治療劑的來源之一。

2.2 抗腫瘤、抗病毒

蟲草黃酮對腫瘤細胞會產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)，這是黃酮類化合物發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的主要途徑之一。在蛹擬青霉菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的3種新的化合物（4″-甲氧基大豆苷、6-甲氧基-4′-羥基異黃酮-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷、4″-甲氧基染料木苷）均顯示出對CHO細胞的強烈毒效應(yīng)，但它們被認為可能是培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物[24]。隨后，廖敏等[20]又自蛹擬青霉中分離出4″-甲氧基大豆苷，這表明蟲草黃酮具有抗腫瘤作用。

此外，黃酮類化合物對病毒也有顯著的抑制效果，如已報道的抗流感病毒、抗乙型肝炎病毒和抗柯薩奇病毒等[25]。Jiang等[21]通過樹脂吸附層析法和HPLC對蛹蟲草黃酮進行分離、純化，得到6，7，2′，4′，5′-五甲氧基黃酮，該化合物顯示對HIV-1蛋白酶的高度抑制作用，可能是新的HIV-1病毒藥物。

2.3 抗炎癥

蟲草黃酮可通過調(diào)節(jié)NF-κB因子來抑制炎癥因子的表達，從而產(chǎn)生抗炎效果。Kim等[26]從生長在發(fā)芽大豆提取物中的蟲草中分離出一種新的異黃酮化合物（CGLM），CGLM能夠直接抑制NCI-H292細胞中NF-κB的活性，并顯著抑制p38 和ERK1/2的磷酸化，保護人肺黏液上皮樣細胞NCI-H292免受表皮生長因子引起的損傷。

2.4 抗氧化

Yu等[27]探究蛹蟲草提取物中具有明顯抗氧化作用的功能成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草中具有較高含量的蟲草素和腺苷并沒有表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，其抗氧化能力可能與蛹蟲草中黃酮類等物質(zhì)清除自由基的能力有關(guān)。關(guān)于蟲草黃酮是否具備較強的抗氧化活性，已成為時下研究熱點。

楊申明等[28]采用體外模型從3個角度評價蟲草花中總黃酮的抗氧化能力，即測定其對·OH、O 2·-和DPPH·的清除能力，研究結(jié)果顯示在一定的試驗濃度范圍內(nèi)，總黃酮與3種自由基的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明蟲草花黃酮具有一定的抗氧化功能。趙聃聃[29]研究發(fā)現(xiàn)蘭坪蟲草菌絲體中的黃酮類化合物清除自由基的能力更強，隨黃酮提取液濃度的上升而逐漸提高。張曦文等[30]測定白化型蛹蟲草中蟲草酸、可溶性蛋白和黃酮等主要活性成分含量，并與其水提物的抗氧化活性進行比較，得出黃酮的含量相對較高，在抗氧化活性物質(zhì)中占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)出較強的活性。劉曉紅等[31]測定蛹蟲草樣品對DPPH·、O 2·-清除能力和銅離子還原能力，比較新鮮的蛹蟲草和干制的蛹蟲草之間抗氧化活性的差異，結(jié)果表明新鮮的蛹蟲草具有更明顯的抗氧化活性。

2.5 抑菌作用

黃酮類化合物是一類pH偏弱酸性的酚類物質(zhì)，會破壞微生物的蛋白質(zhì)，使微生物發(fā)生功能紊亂，抑制微生物的生長或?qū)е滤鼈兊乃劳觥Ａ_珊珊[32]設(shè)計抑菌活性試驗，研究九州蟲草黃酮提取物對大腸桿菌、黑曲霉和白色念珠菌等的抑菌效果，初步證實了九州蟲草黃酮具有一定的抑菌作用，其中細菌的抑菌作用最強，對一些病原真菌也有比較明顯的抑菌作用，結(jié)果顯示最佳抑菌濃度為0.5 mg/mL，最低抑菌濃度隨菌種的不同而發(fā)生變化。

2.6 鎮(zhèn)靜、催眠作用

黃酮類化合物也是蟲草發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。安麗萍等[33]以小鼠自主活動的次數(shù)、大腦中的乙酰膽堿（Ach）、谷氨酸（Glu）、5-羥色胺（5-HT）和 γ-氨基丁酸的含量為指標研究蛹蟲草總黃酮的鎮(zhèn)靜、催眠作用及其機制，結(jié)果揭示蛹蟲草總黃酮可發(fā)揮鎮(zhèn)靜、催眠功效，其作用機制可能是通過上調(diào)人腦中5-HT的含量，并下調(diào)Ach和Glu的含量，從而起到鎮(zhèn)靜、催眠的作用，而對γ-氨基丁酸的含量沒有明顯的影響。

3 蟲草黃酮的提取技術(shù)

從提取物的性質(zhì)、對工業(yè)化的適用程度和環(huán)保等角度考慮，蟲草黃酮的提取方法主要分為傳統(tǒng)的提取法和現(xiàn)代的提取法。傳統(tǒng)的提取方法即指溶劑提取法，現(xiàn)代的提取方法有超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取技術(shù)（圖1）。

3.1 溶劑提取法

溶劑提取法是一種常規(guī)的提取方法，目前在實驗室中應(yīng)用廣泛。黃酮類化合物一般都帶有酚羥基，因此易溶解于極性強的溶劑，如水、甲醇、乙醇等，其中乙醇毒副作用小最為常用。近年來，國內(nèi)研究人員采用溶劑提取蟲草黃酮的研究應(yīng)用較多。羅珊珊等[34]采用正交試驗設(shè)計，使用乙醇回流法從九州蟲草和冬蟲夏草中提取黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)料液比在1∶40（g∶mL）時，用80%乙醇提取3 次，每次提取3 h，提取溫度為80 ℃，蟲草黃酮提取率最高，可達3.730 mg/g。楊申明等[28]分別使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水對蟲草花進行總黃酮的提取，發(fā)現(xiàn)用甲醇和乙醇提取蟲草花總黃酮時，其含量大大高于用乙酸乙酯和水進行總黃酮提取時的總黃酮含量，但當(dāng)甲醇和乙醇用作提取溶劑時，兩者總黃酮的含量并無差別。孫晶波等[35]使用正交試驗優(yōu)化提取不同來源的北冬蟲夏草總黃酮，結(jié)果顯示，以40 倍量的70%乙醇，90 ℃單次回流4 h時，提取蟲草總黃酮的效果最佳。

綜合以上結(jié)果可以看出，溶劑提取法對于提取溫度要求較低，工藝設(shè)備簡單，操作安全，所需成本低，但此法提取會產(chǎn)生大量雜質(zhì)，低回收率，提取物的過濾、濃縮和其他操作需要很長時間以及大量有機溶劑的使用，可能會造成溶劑污染，因此該方法更適合小規(guī)模提取。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2021年

3.2 微波輔助提取

微波輔助提取的原理是不同材料吸收微波能量的能力不同，可以有選擇地加熱材料，在材料細胞內(nèi)產(chǎn)生瞬時的高溫高壓，造成材料細胞壁的破裂，降低傳質(zhì)阻力，從而達到快速溶解、提取材料中活性成分的效果[36]。此法適用于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的提取，具有能耗低、無污染的優(yōu)勢，特別是該方法能夠選擇性提取不同的藥材，非常適合用于天然產(chǎn)物的提取，具有推廣使用價值。羅珊珊等[37]通過正交試驗研究乙醇回流法、微波法和超聲波破碎法從蒙山九州蟲草不同部位提取黃酮的最適工藝，得出從蟲草子座中提取的黃酮含量最高，微波法提取效果最好，超聲波破碎法次之，而乙醇回流法最低。然后，使用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化微波提取九州蟲草黃酮工藝，即在料液比為1∶25（g∶mL）、140 W的微波功率下，提取1.5 min，所得總黃酮產(chǎn)量高達9.35 mg/g[38]。劉春泉等[39]研究微波法從北冬蟲夏草中提取黃酮的最佳工藝，在北冬蟲夏草子座干粉粒徑為60 目，用水進行提取，確定料液比為1∶25（g∶mL），微波功率120 W，提取3 次，提取10 min，此時黃酮提取率最高，達14.69 mg/g。

與傳統(tǒng)提取方法相比，采用微波輔助提取蟲草類黃酮，能大幅度縮短提取時間，節(jié)約能源，提高提取效率，然而用該方法來提取一些非極性物質(zhì)并未取得良好的成效。

3.3 超聲波輔助提取

超聲波輔助提取的作用機制是利用超聲波的空化作用、機械作用和熱效應(yīng)增強介質(zhì)的滲透能力，打破細胞壁，達到加速中草藥活性成分溶出的目的[40]。張國英等[41]首次使用超聲波輔助提取技術(shù)從九州蟲草子座中提取黃酮類化合物，基于單因素試驗得出最佳工藝參數(shù)（料液比為1∶25，70%乙醇和提取時間30 min），從九州蟲草子座中所得的黃酮含量為2.432 mg/g。張永明等[42]考察了溶劑提取法和微波、超聲波輔助提取法從古尼蟲草中提取總黃酮，通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化試驗條件，確定古尼蟲草中總黃酮提取的最適工藝參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲波提取效果最佳，在料液比為1∶30（g∶mL）的情況下，用85%乙醇、80 ℃ 超聲提取10 min，古尼蟲草中總黃酮的提取率高達6.56 %，與銀杏根中總黃酮含量相當(dāng)，此法效率高、速度快。

應(yīng)用超聲波技術(shù)輔助提取蟲草黃酮類物質(zhì)，極大地促進了有效成分的擴散和溶出，大大減少直接用溶劑提取的時間，提取率高，具有節(jié)能、省時、操作簡便等優(yōu)點。但在傳播過程中超聲波的強度會隨著作用區(qū)域的擴大而逐漸減弱，因而超聲輔助提取對提取容器的直徑大小有限制，對于所需的超聲設(shè)備要求較高，因此在目前的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中還存在一定的局限性，有待進一步研究應(yīng)用。

3.4 超臨界流體萃取

超臨界流體萃?。⊿FE）是現(xiàn)代頗為流行的一種“綠色化工提取技術(shù)”，在研究天然藥用植物活性成分當(dāng)中被廣泛使用。臨界點流體具有強滲透性和高溶解能力，目前，CO 2是最常用的超臨界流體。該技術(shù)與蟲草黃酮傳統(tǒng)的提取方法大為不同，其特征是高萃取效率和無溶劑殘余物，可以有效防止熱敏性成分的逸散和活性物質(zhì)被氧化破壞，操作簡便安全，可以通過準確控制臨界點溫度和壓力來實現(xiàn)有選擇地提取、分離和純化出蟲草黃酮，但這種方法可供選擇的溶劑種類有一定的限制，且所耗費的成本高，設(shè)備的先進與否嚴重影響了有效成分的品質(zhì)和得率。朱建民等[43]在溫度40 ℃、壓強25 MPa條件下，靜態(tài)萃取30 min，再動態(tài)萃取120 min，CO 2的流速為1.0 L/min，使用超臨界CO 2流體萃取技術(shù)提取九州蟲草總黃酮，獲得的黃酮含量為1.89 mg/g。

較之于溶劑提取法、超聲和微波提取法，超臨界提取的黃酮純度高、雜質(zhì)少，后續(xù)處理步驟少，測定的準確性高。此外，處于高臨界區(qū)域的流體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，本身對人體無毒性，不易產(chǎn)生污染，安全性高，因此，超臨界流體萃取技術(shù)非常適用于工業(yè)化生產(chǎn)中大規(guī)模提取蟲草黃酮，根據(jù)蟲草黃酮的性質(zhì)，正確選擇萃取時的壓強、溫度、萃取粒子的直徑、流體流速和萃取溶劑等參數(shù)是提高提取效率的關(guān)鍵。

4 結(jié)語與展望

蟲草的物種多樣、資源豐富，是一類珍貴的藥用真菌資源。近年來，國內(nèi)外許多研究人員已對蟲草黃酮的生物活性及其提取進行了一定深度的研究，也取得了不少成果，但是，縱觀當(dāng)前蟲草黃酮的相關(guān)研究進展，總體上還處于起步階段，離產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用還有很大的距離。目前，尚存在以下幾個問題：

（1）蟲草黃酮類成分和蟲草活性研究不同步。目前，大量研究證實蟲草具有多種生物活性，但這些研究大多表明蟲草生藥或其提取物具有某種生物活性，并沒有證實是蟲草中黃酮類成分發(fā)揮相應(yīng)功效或明確與其活性相關(guān)的黃酮類單體物質(zhì)。

（2）有關(guān)蟲草黃酮生物活性的研究仍然存在不足，單一蟲草黃酮成分與其生物活性的構(gòu)效關(guān)系及作用機制目前尚不清楚，還不足以為蟲草黃酮類化合物的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

（3）天然活性成分提取常用的一些現(xiàn)代技術(shù)，如協(xié)同輔助提取、半仿生提取法、高靜壓萃取（HHPE），尚未用于蟲草黃酮的研究應(yīng)用，難以實現(xiàn)蟲草黃酮的高效提取。

（4）不論采用傳統(tǒng)提取法還是現(xiàn)代提取法提取蟲草黃酮，大多數(shù)研究都是基于單因素試驗，并采用正交試驗設(shè)計進一步優(yōu)化提取工藝，試驗次數(shù)較少，只能處理離散水平值，分析并不全面。

因此，針對以上問題，當(dāng)前對蟲草資源的應(yīng)用應(yīng)該在現(xiàn)有的生物活性研究基礎(chǔ)上，著力加強對與其活性相關(guān)的物質(zhì)研究，即黃酮類化合物的系統(tǒng)研究，創(chuàng)新、優(yōu)化蟲草黃酮提取工藝，明確各黃酮類單體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、提取和純化方法，探究蟲草黃酮與其生物活性的構(gòu)效關(guān)系、作用機制，這將有助于進一步開發(fā)蟲草黃酮在功能性食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用市場，創(chuàng)造更大的社會效益和經(jīng)濟效益。

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