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    棗花柱頭熒光染色方法的優(yōu)化*

    2021-04-16 08:39:18任海燕王永康趙愛(ài)玲薛曉芳李登科
    中國(guó)果樹 2021年2期
    關(guān)鍵詞:苯胺藍(lán)花柱花粉管

    任海燕,王永康,趙愛(ài)玲,薛曉芳,李 毅,李登科

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所,果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太谷 030815)

    棗落花落果嚴(yán)重,坐果率低,一般自然坐果率僅1%左右[1],且棗胚敗育普遍存在[2]。許多學(xué)者針對(duì)這一現(xiàn)象,開展了棗柱頭可授性、花粉萌發(fā)情況、授粉受精等開花生物學(xué)特性的研究,國(guó)內(nèi)研究較多的使用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法(MTT)測(cè)定柱頭的可授性[3-6],此方法雖快捷,但可授性強(qiáng)弱指標(biāo)難以量化。相比而言,利用熒光顯微法判斷柱頭可授性和花粉管生長(zhǎng)較為直觀準(zhǔn)確[7-11]。棗花柱微木質(zhì)化,花柱細(xì)胞組織較厚,在熒光顯微觀察時(shí)易出現(xiàn)花粉管生長(zhǎng)過(guò)程被花柱組織遮擋的現(xiàn)象,因此在試驗(yàn)過(guò)程中,常采用適宜濃度的NaOH作為軟化劑軟化花柱,可以達(dá)到預(yù)期的效果。但若NaOH濃度使用不當(dāng),或出現(xiàn)花柱壓片不成形,或花粉管結(jié)構(gòu)不清晰等影響試驗(yàn)效果。為了提高棗花粉管生長(zhǎng)特性等相關(guān)試驗(yàn)的效率,以期得到理想的試驗(yàn)圖片,本研究以‘冷白玉’棗花為試材,對(duì)軟化方法、染色pH環(huán)境進(jìn)行了優(yōu)化,以期為棗花粉管生長(zhǎng)特性的研究提供實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試材料‘冷白玉’棗采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家棗資源圃,該品種盛花期為6月上旬,選取無(wú)病、長(zhǎng)勢(shì)良好的棗吊,定花定果,以黃蕾期(蜜盤剛出蜜)進(jìn)行人工授粉,授粉品種為‘伏脆蜜’,花粉萌發(fā)率為94%。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1材料

    采集棗花,置于FAA(70%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=90∶5∶5)固定液中固定備用。

    1.2.2不同軟化處理的優(yōu)化

    從FAA中取出棗花,蒸餾水清洗10次,分別置于不同的條件進(jìn)行軟化:于8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min;于2 mol/L NaOH溶液中浸泡并文火水煮30 min;于8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min。每處理重復(fù)3次,每次選取棗花30朵。

    1.2.3不同pH值緩沖液處理的優(yōu)化

    棗花經(jīng)過(guò)2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后,經(jīng)不同pH值梯度緩沖液(1 mol/L NaOH與45%冰醋酸配制而成),pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0,浸泡50 min。每處理重復(fù)3次,每次選取棗花30朵。

    1.2.4不同染色劑處理的優(yōu)化

    棗花經(jīng)過(guò)2 mol/L NaOH溶液浸泡并文火水煮30 min軟化后清洗2~3次,經(jīng)緩沖液pH值為7.0浸泡50 min清洗后,置于不同的染色劑:0.1%水溶性苯胺藍(lán),染色30 min;0.1 g水溶性苯胺藍(lán)+0.7 g K3PO4,蒸餾水定容至100 mL,加45%冰乙酸調(diào)至pH值為8.0,染色5 min。每處理重復(fù)3次,每次選取棗花30朵。

    棗花染色后,蒸餾水清洗4~5次后,用刀片和鑷子取出雌蕊,放置在載玻片上,輕蓋蓋玻片,制片后在倒置熒光顯微鏡(Olympus DP71)下觀察并拍照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同NaOH溶液處理對(duì)棗花雌蕊軟化效果的影響

    如圖版2所示,棗花在8 mol/L NaOH溶液中浸泡10 min,花柱表面的花粉粒不清晰,花柱成形(圖版2-A-a);棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min后,花粉管形態(tài)清晰可見(jiàn),且花柱結(jié)構(gòu)基本保持完整(圖版2-A-b);在8 mol/L NaOH溶液中浸泡并在60 ℃恒溫水浴中10 min,花柱表面的花粉粒可以看到,但花柱不成形、破裂,花粉管暴露,不能觀察到完整的花柱結(jié)構(gòu)(圖版2-A-c)。通過(guò)比較,棗花在2 mol/L NaOH溶液中浸泡并水煮30 min,軟化效果好,花柱結(jié)構(gòu)保持完整且花粉管清晰可見(jiàn)。

    2.2 不同pH值緩沖液處理對(duì)花粉管染色效果的影響

    當(dāng)緩沖液pH值為3.0時(shí),花柱細(xì)胞呈藍(lán)色,花粉管染色與其他部分對(duì)比不明顯(圖版2-B-a);當(dāng)pH值為5.0時(shí),花柱細(xì)胞部分呈藍(lán)色,可觀察到少量的花粉(圖版2-B-b);當(dāng)pH值為7.0時(shí),可清晰可見(jiàn)花粉管在花柱道中的伸長(zhǎng)情況,花柱呈透明狀,拍攝效果最佳(圖版2-B-c);當(dāng)pH值為9.0時(shí),花柱細(xì)胞呈黑色,可觀察到部分花粉粒,花柱與背景對(duì)比差,無(wú)法觀察到花粉管的伸長(zhǎng)情況(圖版2-B-d)。由此可見(jiàn),當(dāng)緩沖液pH值為7.0時(shí),觀察花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)情況,效果最佳。

    2.3 不同染色劑處理對(duì)棗花粉管染色效果的影響

    棗花經(jīng)緩沖液浸泡,蒸餾水清洗后在0.1%水溶性苯胺藍(lán)條件下,染液呈酸性,亮藍(lán)色,滴于白紙上有藍(lán)色染暈,染色30 min,觀察可見(jiàn)花柱表面花粉粒情況及花粉在柱頭萌發(fā)情況,但在花柱道中只可觀察到部分花粉管萌發(fā),染色不明顯(圖版2-C-a);在加有K3PO4的苯胺藍(lán)染液,pH值為8.0的條件下,染液呈暗藍(lán)色、清亮,滴于白紙上無(wú)染暈,染色5 min,染色效果好,可清晰觀察到花粉管萌發(fā)情況,花粉管結(jié)構(gòu)明顯(圖版2-C-b)。研究結(jié)果表明,在加有0.7 g K3PO4的0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液中花粉管清晰可見(jiàn),染色效果好。

    3 結(jié)論與討論

    NaOH溶液的強(qiáng)堿性能可以很好地降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分[12-14],從而達(dá)到軟化材料的效果。許多研究者利用NaOH軟化這一原理觀察花粉管生長(zhǎng)特性,但不同樹種所使用的NaOH濃度不同[15-17]。在棗方面,也有不少研究。王堯等[7]、張學(xué)英等[8]、李登科等[10]研究棗花粉萌發(fā)情況和授粉受精過(guò)程均使用8 mol/L NaOH進(jìn)行解離軟化花柱。邵鳳俠等[9]在對(duì)‘中秋酥脆棗’柱頭形態(tài)發(fā)育進(jìn)程與可授性研究中,使用的軟化劑為10 mol/L NaOH軟化10 h。本試驗(yàn)改變了以往使用NaOH浸泡的方式,而是使用2 mol/L NaOH,并進(jìn)行水煮的方式,使花柱組織得到了最大程度的透明化處理,這一結(jié)果在侯思皓等[11]研究棗花粉生長(zhǎng)特性中也同樣得到了證實(shí)。

    本試驗(yàn)比較了3種軟化棗花的方法,認(rèn)為經(jīng)FAA固定的棗花,蒸餾水清洗5~6次后,浸泡在2 mol/L NaOH溶液中,文火水煮30 min,取出棗花蒸餾水清洗5~6次,在pH值為7.0的緩沖液中浸泡50 min,取出棗花清洗5~6次,然后進(jìn)行染色的方法,無(wú)需將棗花從FAA中取出進(jìn)行酒精梯度復(fù)水,簡(jiǎn)化了軟化步驟,避免了棗花柱結(jié)構(gòu)的破裂,使花柱組織得到了最大程度的透明化處理,花粉管觀察效果更佳,大大地提高了實(shí)驗(yàn)效率。

    苯胺藍(lán)壓片觀察花粉萌發(fā)在很多植物上應(yīng)用廣泛,該方法簡(jiǎn)便、快捷、直觀,其原理是苯胺藍(lán)在堿性條件下與花粉管壁中的胼胝質(zhì)發(fā)生反應(yīng),在紫外光下發(fā)出黃綠色熒光[17]。苯胺藍(lán)染液在過(guò)酸或過(guò)堿環(huán)境中,染色效果均差。本研究結(jié)果證實(shí)了苯胺藍(lán)染液在pH值為8.0,染液呈暗藍(lán)色、清亮,滴于白紙上無(wú)染暈。棗花無(wú)需在苯胺藍(lán)染液中過(guò)夜染色,只需在pH值為8.0的苯胺藍(lán)染液染色5 min,即可制片后觀察,花粉管清晰,且與花柱細(xì)胞對(duì)比明顯,染色效果最佳??梢?jiàn),相比傳統(tǒng)方法,圖片效果明顯改善,染液pH值的確定可提高實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。

    傳統(tǒng)方法聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法是將柱頭浸于苯胺藍(lán)-過(guò)氧化氫反應(yīng)液中,通過(guò)觀察柱頭周圍是否呈現(xiàn)藍(lán)色并有大量氣泡來(lái)判斷柱頭是否具有可授性。首先,這種方法需通過(guò)觀察柱頭染色顏色的深淺來(lái)判斷柱頭可授性的強(qiáng)弱,觀察結(jié)果無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)量化。其次,此方法反應(yīng)時(shí)間不一致,一般對(duì)于可授性弱的棗柱頭,反應(yīng)時(shí)間需10~15 min;而對(duì)于可授性強(qiáng)的柱頭,反應(yīng)時(shí)間也需3~5 min,才能觀察到結(jié)果[4-5]。相比而言,通過(guò)熒光顯微鏡能夠直觀地觀察到花粉管生長(zhǎng)的真實(shí)情況,能夠清晰、準(zhǔn)確地反映出授粉后各部分的動(dòng)態(tài)變化[18]。本文介紹的方法進(jìn)一步優(yōu)化了棗柱頭熒光染色方法,主要體現(xiàn)在以下幾方面。①簡(jiǎn)化了處理過(guò)程:將棗花從FAA液中取出后無(wú)需進(jìn)行酒精梯度復(fù)水。②花柱結(jié)構(gòu)保持完整,花粉管更為清晰:軟化處理只需浸泡在2 mol/L NaOH的溶液中,文火水煮30 min即可,無(wú)需在NaOH溶液中浸泡數(shù)小時(shí),避免了較厚的棗花柱組織遮擋花粉管的現(xiàn)象。③節(jié)省了時(shí)間,更加高效:棗花在pH值為8.0的苯胺藍(lán)染液染色5 min即可制片后觀察,無(wú)需在苯胺藍(lán)染液中過(guò)夜染色,節(jié)省了時(shí)間。此外,染液pH值的確定大大地提高了實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。

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