一例Ⅱ型常染色體顯性骨硬化癥患者CLCN7基因突變分析

楊鵬 李燦 羅小慶 莫奇非 張斌 蘇楠 陳林

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院/戰(zhàn)傷組織修復(fù)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究室/全軍軍事訓(xùn)練傷防治與康復(fù)實(shí)驗(yàn)室/骨質(zhì)疏松與骨發(fā)育中心/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042

骨硬化癥(osteopetrosis)，或稱原發(fā)性脆骨硬化癥，又稱石骨癥、大理石骨病(Marble bone disease)等，該疾病是以骨代謝異常、全身性骨密度增高為主要特點(diǎn)的遺傳性骨病[1]。骨硬化癥首次報道于1904年，研究人員發(fā)現(xiàn)此類骨病的產(chǎn)生與破骨細(xì)胞的發(fā)育異常以及破骨細(xì)胞的功能障礙存在十分緊密的相關(guān)性[1-3]。根據(jù)臨床表型及遺傳學(xué)特征可分為常染色隱性遺傳骨硬化癥(autosomal recessive osteopetrosis，ARO)[4]和常染色體顯性遺傳骨硬化癥(ADO)[8]，二者的致病基因已基本闡明；此外，還有一種致病基因尚未明確的骨硬化癥為常染色隱性遺傳的中間型骨硬化癥(intermediate autosomal osteopetrosis，IAO)[5]。其中，ADO根據(jù)致病基因和臨床表型的差異又可分為2種類型：Ⅰ型(ADO Ⅰ)和Ⅱ型(ADO Ⅱ)。自2009年國內(nèi)首次報道至今，多項(xiàng)研究表明ADO Ⅱ類型骨硬化是一種較為常見的骨硬化類型，通常認(rèn)為其發(fā)病原因與多通道膜蛋白基因(chloride channel,voltage-sensitive，CLCN)中CLCN7的突變密切相關(guān)[6-8]。經(jīng)過近十幾年研究，關(guān)于CLCN7基因突變與骨硬化癥關(guān)系的研究資料日漸完善，章振林等[9]已對二者之間的關(guān)系做了詳細(xì)總結(jié)。本研究中我們對一例ADO Ⅱ類型骨硬化癥患者的CLCN7基因外顯子序列進(jìn)行測序分析，結(jié)合臨床表型對該類型骨硬化癥病例加以研究。

1 材料和方法

1.1 對象

患者，女，25歲，外院體檢時發(fā)現(xiàn)骨量增加，為復(fù)查來我院就診。患者無乏力、無骨骼疼痛等癥狀，否認(rèn)骨折史。個人史：無特殊。家族史：父母非近親婚配，其母親患有骨硬化癥(28歲時去世)。查體：步態(tài)正常；脊柱和四肢無畸形。進(jìn)一步對患者進(jìn)行了雙能X線骨密度檢測；同時，利用X線對其胸腰椎、骨盆進(jìn)行檢查。實(shí)驗(yàn)室檢查：對患者進(jìn)行血常規(guī)、血清鈣磷、骨代謝指標(biāo)(甲狀旁腺素、骨鈣素、血清降鈣素、骨堿性磷酸酶、25-羥基維生素D(25OHD)、β膠原特殊序列、總Ⅰ型膠原氨基端延長肽)等進(jìn)行檢測。

1.2 試劑與儀器

外周血收集管(BD，美國)、DNA純化試劑盒(Promega，美國)、高保真PCR試劑盒(Promega，美國)、瓊脂糖 (Biowest，西班牙)、引物 (重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司)、PCR儀(BioRad，美國)、電泳儀(BioRad，美國)、凝膠成像儀(BioRad，美國)。

1.3 方法

征得患者及患者父親同意之后，簽署知情同意書，收集臨床資料和空腹抽取患者及其父親的外周靜脈血樣本，分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱，取1 mL血液樣本用DNA抽提試劑盒提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。同時從樣本庫中隨機(jī)選取50個正常人的DNA樣本作為對照。針對骨硬化癥最常見致病基因CLCN7[8]，利用高保真PCR試劑盒擴(kuò)增其所有外顯子區(qū)域。PCR反應(yīng)體系為50 μL，退火溫度根據(jù)不同片段大小控制在 55～65 ℃。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定得到條帶清晰、大小正確的產(chǎn)物之后，交由上海天昊生物科技有限公司對產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。測序后對比分析患者與正常人CLCN7外顯子區(qū) 的差異。

2 結(jié)果

2.1 影像及血清學(xué)結(jié)果

患者X線片顯示髖部和股骨骨密度增加，髂骨出現(xiàn)“骨中骨”現(xiàn)象(圖1 A，箭頭所示)，椎體骨密度增加，成“夾心餅”樣(圖1B-C，箭頭所示)。骨密度結(jié)果顯示腰椎1～4 Z值為13，股骨頸Z值為7.8，全髖Z值為10(表1)。血常規(guī)、肝腎功等無明顯異常，骨代謝指標(biāo)中除25OHD降低外(表2)，其余均在正常范圍內(nèi)。

注：A 患者髖部正位片顯示骨密度增加，髂骨表現(xiàn)為“骨中骨”現(xiàn)象，長骨骨皮質(zhì)增厚；B-C：患者胸腰椎正側(cè)位相顯示廣泛的骨密度增加，椎體終版增厚高，呈 “夾心餅”征。圖1 患者骨骼X線表現(xiàn)Fig.1 X-ray appearance of the bone in the patient

表1 患者骨密度Table 1 Bone mineral density of the patient

表2 患者的生化指標(biāo)Table 2 Blood biochemical indexes of the patient

通過對該患者CLCN7基因外顯子雙向測序分析發(fā)現(xiàn)，該患者CLCN7基因的9號外顯子發(fā)生746位堿基C(c.746C>T)純合錯義突變，導(dǎo)致249位脯氨酸變?yōu)榱涟彼?p.Pro249Leu)(圖2)，50例正常人中均未發(fā)現(xiàn)該突變。患者父親提供的血液樣本測序該位點(diǎn)無此類突變。

注：A 正常人CLCN7基因9號外顯子測序結(jié)果；B 患者CLCN7基因的9號外顯子發(fā)生c.746C>T錯義純合突變。圖2 患者CLCN7基因測序結(jié)果Fig.2 CLCN7 sequencing result of the patient

3 討論

骨硬化癥的主要影像學(xué)特征為骨密度增高、骨骺增寬，該病理癥狀常導(dǎo)致不同程度的并發(fā)癥，給患者生活帶來極大的影響。骨硬化癥患者即使臨床癥狀較輕也有可能導(dǎo)致骨髓腔變窄，致使骨髓腔容積降低，骨髓含量減少，進(jìn)而影響造血功能，造成貧血[10]。另一方面，骨量的異常增加，可能會壓迫感官神經(jīng)，導(dǎo)致聽力、視力減弱或異常等[11-12]；此外，骨硬化癥患者還有可能出現(xiàn)面癱、顱面部骨結(jié)構(gòu)改變等[13]，嚴(yán)重者還可能導(dǎo)致失明[14]；惡性骨硬化或直接導(dǎo)致骨折[15]。大量研究表明，骨硬化癥的生成與發(fā)病與破骨細(xì)胞生理狀態(tài)緊密相關(guān)，破骨細(xì)胞的發(fā)育異常以及破骨細(xì)胞的功能缺陷都會導(dǎo)致骨硬化癥[1-3]。

本報道病例為II型常染色體顯性遺傳骨硬化癥(ADO II)，又稱為Albers-Sch?nberg 病(OMIM 166600)，該病以遲發(fā)性和臨床表現(xiàn)多樣性為主要特征。發(fā)病人群在兒童、青少年及成人中均有分布，主要影像學(xué)特征是脊柱呈“夾心餅”樣和髂翼“骨中骨”表現(xiàn)。雖然ADO II是常染色體顯性遺傳性疾病，但是其外顯率在60 %～90 %之間[16]，發(fā)病率極高，對患者身心健康造成極大危害。

CLCN7是導(dǎo)致ADO II的關(guān)鍵基因，人CLCN7基因定位于染色體16p13.3，由25個外顯子構(gòu)成。CLCN7基因編碼的氯離子通道蛋白是一種多通道膜蛋白，該蛋白由兩個同源單體構(gòu)成，每個單體含18個α螺旋體，這些α螺旋體中的4個具有氯離子(Cl-)結(jié)合位點(diǎn)。該通道蛋白同時也是質(zhì)子泵，其主要功能是在將Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的同時將氫離子(H+)反向轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。CLCN7基因的表達(dá)是破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能的關(guān)鍵，氯離子通道蛋白高表達(dá)于成熟破骨細(xì)胞褶皺緣和溶酶體的隔室內(nèi)，通過其轉(zhuǎn)運(yùn)功能向骨吸收陷窩內(nèi)分泌H+，使得整個骨陷窩的pH值維持在4左右，通過形成酸性骨吸收陷窩溶解骨基質(zhì)的方式來保證破骨細(xì)胞骨吸收功能的正常發(fā)揮。簡言之，該蛋白可以通過離子交換的方式把Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)至破骨細(xì)胞的小囊泡中的同時將大量H+泵出到骨吸收陷窩中形成能夠使破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收功能的酸性環(huán)境[17]。雖然CLCN7不直接參與溶酶體酸化的過程，但是它可能為構(gòu)建溶酶體電荷平衡起關(guān)鍵作用[18-19]。有研究表明，在敲除CLCN7基因的小鼠體內(nèi)會出現(xiàn)骨硬化癥表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然小鼠體內(nèi)含有正常數(shù)量的破骨細(xì)胞，但其破骨細(xì)胞中的溶酶體積蓄細(xì)胞功能異常，破骨細(xì)胞吸收陷窩內(nèi)不能形成適宜的酸性環(huán)境供其發(fā)揮正常的骨吸收功能[2,19]，直接導(dǎo)致了破骨細(xì)胞功能降低。此外，通過siRNA處理的方法干擾CLCN7基因的表達(dá)會使溶酶體形成酸性環(huán)境的能力減弱，并證明氯離子通道蛋白7可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)Cl-透過溶酶體膜進(jìn)入溶酶體的方式來促進(jìn)酸性環(huán)境的形成[21]。因此CLCN7基因缺失可導(dǎo)致破骨功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致骨硬化癥。

本例患者無明顯臨床癥狀，X線片顯示多個骨骼部位骨密度增加，有“夾心餅”樣征和“骨中骨”現(xiàn)象，屬于較為典型常染色體顯性骨硬化癥中的ADO Ⅱ型骨硬化癥。實(shí)驗(yàn)中對CLCN7外顯子測序顯示在9號外顯子上發(fā)生錯義突變(純合突變)，導(dǎo)致p.Pro249Leu，該突變位點(diǎn)位于構(gòu)成氯離子通道蛋白的α螺旋體中的4個具有Cl-結(jié)合位點(diǎn)的α螺旋體中的一個，該突變可能導(dǎo)致氯離子通道蛋白7的Cl-結(jié)合能力降低，使得溶酶體的酸化功能異常，導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能降低，進(jìn)而引發(fā)骨硬化癥。比較之前國內(nèi)外文獻(xiàn)中報道的42種與ADO II型骨硬化癥相關(guān)的CLCN7突變[8-9]，該突變在國內(nèi)為首次發(fā)現(xiàn)并報道。

致病基因的測序檢測可以幫助患者及醫(yī)生及時確診病情，豐富致病基因譜，為疾病與基因型之間關(guān)系的研究提供研究素材。但是，ADO Ⅱ型骨硬化癥的基因診斷及報道更是依然較少，致使醫(yī)生及科研人員無法充分地對該病進(jìn)行總結(jié)分析，尋找相應(yīng)的預(yù)防檢測及治療措施。骨硬化癥目前尚無有效的治療方法，希望通過我們的臨床診斷及研究能夠?yàn)樵摬“Y的研究提供一些案例支撐和理論基礎(chǔ)，為揭示骨硬化癥的機(jī)制和治療措施的研究提供一定的論據(jù)。