黑曲霉3.316β-葡萄糖苷酶底物親和性研究

侯林燕，朱鳳妹

（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島066600）

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase），因其能將結(jié)合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵水解，所以也被稱為β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它屬于纖維素酶系的一種，能夠水解纖維二糖來(lái)減少纖維素水解過(guò)程中的可逆限制。該酶可以從微生物和動(dòng)植物中獲得，比如細(xì)菌[1]、真菌[2]、霉菌[3]、水果、龍井茶葉[4-5]、昆蟲(chóng)[6]等。來(lái)源不同的β-葡萄糖苷酶所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在差異，從而導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)不同。根據(jù)酶作用底物的糖苷鍵的不同可以將β-葡萄糖苷酶分成只水解烴基-β-葡萄糖苷鍵的酶、只水解芳香基-β-葡萄糖苷鍵的酶和既能水解烴基-β-葡萄糖苷又能水解芳香基-β-葡萄糖苷[7-8]的酶。底物種類的不同與β-葡萄糖苷酶發(fā)生反應(yīng)時(shí)的連接方式也不同。通常采用分子對(duì)接了解小分子配體與大分子受體的連接方式[9-11]，分子對(duì)接的常用軟件有AutoDock、LeDOCK、MOE Dock 等[12-14]，可視化軟件有MOE[15]、Pymol[16]等。本次試驗(yàn)采用分子對(duì)接了解3 種底物與β-葡萄糖苷酶的連接方式，從分子角度找到兩者結(jié)合穩(wěn)定的原因，為β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)性質(zhì)的理論研究提供了一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger 3.316）：中國(guó)菌種保藏中心；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside，pNPG）：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：上海羽朵生物科技有限公司；纖維二糖：MERCK 公司；水楊苷：RHAWN 公司；對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）：武漢克米克生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 底物與酶的分子對(duì)接

在能力最小化基礎(chǔ)上將二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，利用LigX 優(yōu)化靶的質(zhì)子化狀態(tài)和氫的取向，殘基Asp280 附近是結(jié)合區(qū)域。AMBER10 ∶EHT 的力場(chǎng)和反應(yīng)場(chǎng)（R 場(chǎng)）的隱式溶劑化模型用于對(duì)接前，采用半柔性對(duì)接方式，對(duì)位置進(jìn)行約束，但允許受體口袋的側(cè)鏈根據(jù)配體構(gòu)象移動(dòng)。側(cè)鏈原子束縛到原始位置的重量為10，過(guò)渡態(tài)由London dG 評(píng)分，對(duì)前30 個(gè)復(fù)合物過(guò)渡態(tài)進(jìn)行力場(chǎng)細(xì)化，然后對(duì)GBVI/WSA dG 重新評(píng)分，結(jié)果以MOE 軟件可視化。

1.3 酶活測(cè)定方法

DNS 法測(cè)定酶活性[17]：配制0.02 mmol/L，pH 4.5 的水楊苷溶液，取2 mL 底物溶液與1 mL 酶液于60 ℃水浴，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min 終止反應(yīng)，測(cè)定OD540值。將滅活的酶液作為空白對(duì)照處理。

pNPG 酶活測(cè)定方法[18]：50 μL pNPG 的溶液加入1.5 mL 的pH 4.5 的緩沖液，在60 ℃下預(yù)熱10 min。加入500 μL 的酶液，反應(yīng)10 min，取410 μL 混合液，加入490 μL 的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，測(cè)定OD400值。

纖維二糖測(cè)定方法[19]：取pH 4.5，濃度為4 mmol/L的纖維二糖溶液70 μL 加入酶液70 μL，于60 ℃下發(fā)生反應(yīng)，加入2.1 mL 的葡萄糖氧化酶生化分析顯色液，反應(yīng)10 min，測(cè)定OD520值。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

1.4.1 DNS 法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

測(cè)定還原糖采用DNS 比色法，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量OD 值。

1.4.2 pNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

測(cè)定pNP 采用pNPG 法，將不同濃度的pNP（mmol/L）于400 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量OD 值。

1.4.3 葡萄糖氧化酶法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量OD 值。

1.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別配制不同濃度的底物溶液，其中水楊苷濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L；pNPG 的濃度為1、2、5、7、10 mmol/L；纖維二糖的濃度為1、2、3、4、5 mmol/L；按1.3 酶活測(cè)定方法，酶與底物混合液在pH 4.5，溫度為60 ℃條件下反應(yīng)，每隔2 min，加入各自對(duì)應(yīng)的反應(yīng)終止劑，分別測(cè)定OD540值、OD400值、OD520值。根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法求3 種底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果

以葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.431 5x-0.020 8（R2=0.994 4）；以pNP 濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=6.594 4x-0.002 1（R2=0.998 8）。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.012x+2.213 6（R2=0.998 7）。

2.2 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果

2.2.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果

纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 β-葡萄糖苷酶與纖維二糖的對(duì)接復(fù)合物Fig.1 Complex of β-glucosidase with cellobiose

如圖1A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)物為纖維二糖，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結(jié)果顯示纖維二糖在預(yù)定的結(jié)構(gòu)“活性凹槽處”[20]與酶連接。利用MOE 軟件得到兩分子連接的二維結(jié)構(gòu)圖。如圖1B 所示，與纖維二糖對(duì)接時(shí)，存在3 個(gè)氫鍵和3 個(gè)H-π 共軛。兩個(gè)氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp280 側(cè)鏈形成的，另一個(gè)氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp92 形成的。2 個(gè)H-π 共軛是Tyr511 同時(shí)與纖維二糖形成，另一個(gè)由Trp281 與纖維二糖形成。

2.2.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果

水楊苷與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 β-葡萄糖苷酶與水楊苷的對(duì)接復(fù)合物Fig.2 Complex of β-glucosidase with salicin

如圖2A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)物為水楊苷，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結(jié)果顯示水楊苷在預(yù)定的結(jié)構(gòu)活性凹槽處與酶連接。二維結(jié)構(gòu)如圖2B 可知，在對(duì)接時(shí)，存在4 個(gè)氫鍵，Asp92 作為氫受體與水楊苷相連2 個(gè)氫鍵，Asp280 作為氫受體與水楊苷相連1 個(gè)氫鍵，Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體與水楊苷上的同一個(gè)羥基形成氫鍵。

2.2.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果

pNPG 與β-葡萄糖苷酶對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖3。

如圖3A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)物為pNPG，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結(jié)果顯示pNPG 在預(yù)定的結(jié)構(gòu)活性凹槽處與酶連接。二維結(jié)構(gòu)如圖3B，在對(duì)接時(shí)存在4 個(gè)氫鍵，Asp92 和Ser451 側(cè)鏈與底物不同羥基位點(diǎn)處分別形成一個(gè)氫鍵、Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體同時(shí)與pNPG 上的羥基形成一個(gè)氫鍵。

圖3 β-葡糖苷酶與pNPG 的對(duì)接結(jié)果Fig.3 Complex of β-glucosidase with pNPG

2.2.4 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對(duì)接分?jǐn)?shù)

3 種底物與β-葡萄糖苷酶對(duì)接分?jǐn)?shù)見(jiàn)表1。

表1 3 種底物與β-葡萄糖苷酶的對(duì)接分?jǐn)?shù)Table 1 The docking score of three substrate with β-glucosidase

由表1 可知，纖維二糖的能量分?jǐn)?shù)最小，在3 種底物與酶復(fù)合物中屬于最穩(wěn)定的復(fù)合狀態(tài)，也就說(shuō)明纖維二糖與酶的結(jié)合力在三者中最強(qiáng)。結(jié)合能量的大小與結(jié)合時(shí)形成的氫鍵和H-π 共軛有關(guān)，其中H-π 共軛即芳香氫鍵在對(duì)多肽和蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面、提高底物的親和力和催化效率起著重要作用[21]。這可能是纖維二糖較水楊苷和pNPG 作為底物時(shí)與酶的復(fù)合物相對(duì)穩(wěn)定的原因。

2.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

2.3.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)方程

以纖維二糖為底物時(shí)，以底物濃度（S）的倒數(shù)1/[S]作為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速度（V）的倒數(shù)1/V 為縱坐標(biāo)，得到纖維二糖為底物時(shí)的動(dòng)力學(xué)方程結(jié)果如圖4 所示。

2.3.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)方程

以水楊苷為底物時(shí)，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，計(jì)算所得到的動(dòng)力學(xué)方程結(jié)果如圖5 所示。

2.3.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)方程

以pNPG 為底物時(shí)，根據(jù)根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，計(jì)算得到的動(dòng)力學(xué)方程結(jié)果如圖6 所示。

圖4 纖維二糖的動(dòng)力學(xué)方程Fig.4 Kinetic equation of cellobiose

圖5 水揚(yáng)苷的動(dòng)力學(xué)方程Fig.5 Kinetic equation of salicin

圖6 pNPG 的動(dòng)力學(xué)方程Fig.6 Kinetic equation of pNPG

根據(jù)3 個(gè)方程計(jì)算可得，纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對(duì)應(yīng)的Km分別為5.567、5.820、1.527 mmol/L，則Km最小的為pNPG，這表明酶對(duì)pNPG 的親和力明顯高于酶對(duì)纖維二糖和水楊苷的親和力；最大反應(yīng)速率由高到低依次為66.138、8.886 和1.013 μmol/（min·mg），則酶與纖維二糖為底物時(shí)的最大反應(yīng)速率是酶與水楊苷和酶與pNPG 最大反應(yīng)速率的7.44 倍和65.28倍；纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對(duì)應(yīng)的催化效率分別為14.728、2.068 和0.377，這表明當(dāng)以纖維二糖為底物時(shí)有最大的催化效率，且分別是以水楊苷和pNPG 為底物時(shí)的7.12 倍和39.07倍。

3 結(jié)論與討論

本研究采用分子對(duì)接將3 種β-葡萄糖苷酶的底物與該酶進(jìn)行對(duì)接，從三維結(jié)構(gòu)上初步了解β-葡萄糖苷酶與底物分子接觸發(fā)生反應(yīng)時(shí)的連接方式，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種底物均在β-葡萄糖苷酶的凹槽處進(jìn)行了對(duì)接，其中在與水楊苷和pNPG 對(duì)接時(shí)，活性位點(diǎn)相鄰的Ser451、Tyr248、Asp92 和Asp98 會(huì)與底物形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)。有的一個(gè)氨基酸與底物的兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合生成氫鍵，有的兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈與底物的一個(gè)位點(diǎn)同時(shí)生成氫鍵，產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能與不同氨基酸所帶電荷數(shù)以及所形成氫鍵類型有關(guān)[22-25]；在與纖維二糖對(duì)接時(shí)，除氨基酸與底物形成的3 個(gè)氫鍵外，生成了3 個(gè)H-π 共軛，由于陽(yáng)離子-π 能夠增強(qiáng)周圍形成氫鍵的氨基酸側(cè)鏈的成鍵能力[26]，進(jìn)而影響了酶的催化效率和反應(yīng)速率。

通過(guò)對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析可知，pNPG 最接近β-葡萄糖苷酶天然底物，纖維二糖為底物時(shí)，復(fù)合物結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定，催化效率以及反應(yīng)速率也最高，這結(jié)果符合上述分子對(duì)接結(jié)果。本次試驗(yàn)結(jié)果找到了β-葡萄糖苷酶的最適底物，并從分子方面解釋了底物與酶復(fù)合物連接的方式，同時(shí)通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了分子對(duì)接的可靠性，為以后β-葡萄糖苷酶的分子改造提供了設(shè)計(jì)方法與試驗(yàn)基礎(chǔ)。