大鱗副泥鰍蛋白制備ACE抑制肽的酶解方式研究

何澤賀，肖宇，劉建朝，桑亞新，孫紀(jì)錄*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.唐山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河北唐山063000）

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一種鋅蛋白酶，在調(diào)節(jié)血壓中起著重要作用。ACE 可以水解血管緊張素-I（無活性的十肽），形成血管緊張素-II（有活性的八肽），收縮血管，并使血管舒張劑緩激肽失活[1]。因此，抑制ACE 活性被認(rèn)為對(duì)預(yù)防高血壓有效。合成的ACE 抑制劑，如卡托普利、依那普利和賴諾普利等，已被用于治療高血壓的藥物。但是，合成的ACE 抑制劑具有不良副作用，如引發(fā)咳嗽、味覺障礙和皮疹。因此，目前通過酶解食物蛋白制備食源性的ACE 抑制肽，已獲得廣泛關(guān)注[2]。

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus），屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，主要分布于長(zhǎng)江、嘉陵江和岷江水系、遼河中下游、黃河及黑龍江等地區(qū)，是一種營(yíng)底棲生活的小型魚類。大鱗副泥鰍的蛋白質(zhì)含量約為20%，脂肪含量約為2%，是功能性食品開發(fā)與綜合利用的優(yōu)質(zhì)蛋白[3]。泥鰍還具有多種生理活性，可預(yù)防血管硬化，對(duì)高血壓、貧血等患者有輔助治療作用。因此，利用泥鰍蛋白制備ACE 抑制肽是一項(xiàng)值得探究的工作。

目前，以泥鰍為原料制備ACE 抑制肽的研究，多選用菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶，進(jìn)行酶解工藝的優(yōu)化和營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)。姚東瑞等[4]將用泥鰍制備的ACE 抑制肽進(jìn)行了初步純化，李瑩等[5]進(jìn)行了更深一步的純化，獲得了ACE 抑制肽氨基酸序列Ala-His-Leu-Leu（452 Da）。然而，這些報(bào)道對(duì)于所用蛋白酶的選擇原因并未進(jìn)行深入的解釋。ACE 抑制肽的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）的研究顯示[6]，ACE 抑制肽的C 端氨基酸是與ACE 活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，其疏水性和肽的ACE 抑制活性之間呈正相關(guān)[7]。C 端氨基酸為具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸或脯氨酸時(shí)，ACE 抑制肽的活性一般較強(qiáng)，如Ile-Pro-Pro 和Val-Pro-Pro[8]。大多數(shù)天然降血壓肽的C-末端都具有脯氨酸，而且，目前廣泛用于治療高血壓的肽類藥物，如卡托普利和賴諾普利，都是C 端為脯氨酸的化學(xué)合成品。同時(shí)，ACE 抑制肽的活性與肽段長(zhǎng)度有關(guān)，小分子量寡肽活性高于大分子量寡肽，2 個(gè)～12 個(gè)氨基酸的寡肽活性較強(qiáng)。

本文根據(jù)大量已知ACE 抑制肽的序列分析，由不同蛋白酶的作用位點(diǎn)專一性來選擇水解泥鰍蛋白的蛋白酶種類。α-胰凝乳蛋白酶可從酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基處切斷肽鍵，堿性蛋白酶的作用位點(diǎn)在疏水性氨基酸末端，脯氨酸蛋白酶是一種高度專一的蛋白酶，它只從脯氨酸的羧基端裂解多肽。因此，本文首先使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析大鱗副泥鰍蛋白的氨基酸組成，然后，選擇這3 種蛋白酶對(duì)大鱗副泥鰍蛋白進(jìn)行酶解方式的研究，并使用N-三（羥甲基）甲基甘氨酸十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）[9]進(jìn)一步分析不同蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白水解的情況，旨在為制備高活性的ACE 抑制肽提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鱗副泥鰍：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技市場(chǎng)。取回后，于沸水中熱燙約30 s 去黏液，去頭、尾、皮、骨、內(nèi)臟，用攪拌機(jī)將泥鰍肉搗碎，得到肉糜，-20 ℃冷凍貯藏。

α-胰凝乳蛋白酶（3 000 U/mg）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；脯氨酸蛋白酶（26 U/mL）：夏盛（北京）生物科技開發(fā)有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（2.0 U/mL）、N-[3-（2-呋喃）丙烯醇酰]-2-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸[N-（3-（2-furyl）acryloyl）-L-phenylalanyl-glycyl-glycine，F(xiàn)APGG]、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris]、三（羥甲基）甲基甘氨酸：美國(guó)Sigma 公司；Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

JYL-C020E 絞肉機(jī)：九陽股份有限公司；FS-2 勻漿機(jī)：鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；Beta1-8 LD plus 冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ 公司；SHA-B 水浴恒溫振蕩器：江蘇正基儀器有限公司；ST5000pH 計(jì)：美國(guó)奧豪斯公司；5418 R 冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司；BSA 電子天平：德國(guó)賽多利斯公司；MSH-R-03P 數(shù)顯磁力加熱攪拌器：杭州秋籟科技有限公司；HH-601 超級(jí)恒溫水浴鍋：常州迅生儀器有限公司；MIX1000 渦旋混勻儀：廣東佛衡儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泥鰍蛋白的氨基酸組成測(cè)定

將大鱗副泥鰍蛋白置于水解管中，加入6 mol/L 的HCl 溶液水解24 h，使用高效液相色譜法測(cè)定除色氨酸以外的17 種氨基酸含量。其中色氨酸用NaOH 水解后再測(cè)定[10-11]。

1.3.2 泥鰍蛋白酶解工藝流程

泥鰍肉糜→解凍→勻漿→酶解→滅酶（沸水，10min）→冷卻→離心（4 000 r/min，20 min）→取上清液→-18 ℃保存或凍干備用。

1.3.3 泥鰍肉糜處理

泥鰍肉糜常溫解凍，然后與磷酸緩沖溶液制備成10%的肉糜勻漿。

1.3.4 泥鰍蛋白的單一酶解

分別使用脯氨酸蛋白酶、堿性蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶對(duì)泥鰍肉糜勻漿進(jìn)行單一酶解。在酶解過程中，分時(shí)段取樣，測(cè)定水解度和ACE 抑制率。3 種蛋白酶的酶解條件如表1 所示[12-13]。

表1 3 種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic conditions for three kinds of proteases

1.3.5 泥鰍蛋白的復(fù)合酶解

本研究將復(fù)合酶解分為雙酶分步酶解和雙酶同步酶解兩種酶解方式。

1.3.5.1 雙酶分步酶解

試驗(yàn)分為兩組，酶解方式①：在泥鰍肉糜勻漿中，先加入堿性蛋白酶，在50 ℃、pH10、添加量1 000 U/g的條件下酶解，酶解時(shí)間為堿性蛋白酶最佳酶解時(shí)間，然后，調(diào)節(jié)條件為40 ℃、pH4.2，再加入脯氨酸蛋白酶5 U/g 繼續(xù)酶解。酶解方式②：先加入脯氨酸蛋白酶，在40 ℃、pH4.2、添加量5 U/g 的條件下酶解，酶解時(shí)間為脯氨酸蛋白酶最佳酶解時(shí)間，然后，調(diào)節(jié)條件為50 ℃、pH10，再加入堿性蛋白酶1 000 U/g 繼續(xù)酶解。

在酶解過程中，分時(shí)段取樣，測(cè)定ACE 抑制率[14-16]。

1.3.5.2 雙酶同步酶解

在泥鰍肉糜勻漿中，同時(shí)加入堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶，堿性蛋白酶的有效溫度范圍為20 ℃～60 ℃，有效pH6～11。脯氨酸蛋白酶的有效溫度范圍15 ℃～60 ℃，有效pH3～7。所以選擇復(fù)合酶解條件為40 ℃、pH7、堿性蛋白酶添加量為1 000 U/g、脯氨酸蛋白酶添加量為5 U/g。

在酶解過程中，分時(shí)段取樣，測(cè)定ACE 抑制率[14-16]。

1.3.6 水解度的測(cè)定方法

將樣品酶解液稀釋至合適倍數(shù)，取2.00 mL 稀釋液，向其中加入1.00 mL 茚三酮顯色劑，混勻后，沸水浴加熱15 min。然后，在冷水中冷卻，終止顯色反應(yīng)。然后，加入5.00 mL 40%乙醇溶液，渦旋振蕩。室溫（25 ℃）放置15 min，570 nm 處測(cè)定吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：制備1 000 mg/L 甘氨酸溶液，稀釋該溶液使其最終顯色時(shí)濃度范圍為0.5 mg/L～6.0 mg/L。取2 mL 待測(cè)液進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后于570 nm 處測(cè)定其吸光度值，以加入蒸餾水的試樣為空白。根據(jù)測(cè)定值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶解液中的-NH2的含量（μmol/mL），進(jìn)一步根據(jù)如下公式計(jì)算水解度（degree of hydrolysis，DH）[17]。

式中：h 為水解過程中每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵含量，mmol/g；htot為每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵含量，mmol/g，根據(jù)泥鰍蛋白氨基酸組成為8.4 mmol/g；6.25 為蛋白質(zhì)系數(shù)；N 為蛋白質(zhì)氮含量，mmol/g。

1.3.7 ACE 抑制率測(cè)定方法

將10 μL 的ACE 溶液（0.25 U/mL）和10 μL 蛋白水解液加入微孔板的微孔中但不混合，加入150 μL 經(jīng)過預(yù)熱的底物（1.0 mmol/L FAPGG 溶解于50 mmol/L 的Tris-HCl，pH7.5，包含0.3 mol/L NaCl），使其開始反應(yīng)。迅速將微孔板放入酶標(biāo)儀中并加熱到37 ℃，每1 min 記錄1 次在340 nm 下的吸光值，共記錄20 min?？瞻讓?duì)照使用10 μL 的緩沖液代替蛋白水解液。以吸光值（A340）對(duì)時(shí)間作曲線，計(jì)算斜率[18]。

ACE 抑制率/%=（1-ΔA抑制劑/ΔA空白）×100

式中：ΔA抑制劑為添加抑制劑，吸光值對(duì)時(shí)間的曲線在10 min～20 min 的斜率；ΔA空白為空白對(duì)照，吸光值對(duì)時(shí)間的曲線在10 min～20 min 的斜率。

IC50為抑制50%ACE 活性時(shí)所需酶解樣品的質(zhì)量濃度。用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件的概率單位法計(jì)算。

1.3.8 Tricine-SDS-PAGE

將泥鰍蛋白酶解物與上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，12 000 r/min 離心5 min，上清液為待電泳樣品。配制16.5%的分離膠、夾層膠和濃縮膠，上樣10 μL，80 V 恒壓電泳30 min，100 V 恒壓電泳至終點(diǎn)[19]。用考馬斯亮藍(lán)R250 過夜染色，脫色至背景無色，然后拍照記錄并分析條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Means±SD 表示，運(yùn)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件做方差分析，比較各組之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鱗副泥鰍蛋白的氨基酸組成分析

大鱗副泥鰍蛋白的氨基酸組成見表2。

表2 大鱗副泥鰍蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of loach protein

表2 表明大鱗副泥鰍蛋白中脯氨酸和芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）占氨基酸總量的11.756%。左琦等[6]分析了食源性ACE 抑制肽C 末端氨基酸出現(xiàn)頻率，脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸是ACE 抑制肽的主要C 端氨基酸。由氨基酸分析結(jié)果得出大鱗副泥鰍是制備ACE 抑制肽的良好來源。其中脯氨酸含量為3.540%，在魚類蛋白中含量較高，使用泥鰍蛋白制備C 末端為脯氨酸的ACE 抑制肽原料充足。大鱗副泥鰍蛋白的疏水性氨基酸含量達(dá)39.823%，芳香族氨基酸含量8.216%，支鏈氨基酸含量18.102%。黎觀紅[20]研究了多種蛋白質(zhì)的氨基酸組成與其酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性之間的關(guān)系，通過多元統(tǒng)計(jì)分析得出，蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸含量、芳香族氨基酸含量、支鏈氨基酸含量均與酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性呈正相關(guān)，它們是泥鰍蛋白具有降壓特性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通過蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白專一性酶解，釋放的含有這些特定氨基酸的肽段，有可能具有較高的降壓活性。

2.2 單一酶解方式產(chǎn)生泥鰍蛋白ACE 抑制肽的進(jìn)程

2.2.1 脯氨酸蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況

脯氨酸蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況見圖1。

圖1 脯氨酸蛋白酶酶解泥鰍蛋白過程中水解度和ACE 抑制率的變化Fig.1 Changes of hydrolysis degree and ACE inhibition rate during hydrolysis of loach protein by brewers clarex

由圖1 可見，脯氨酸蛋白酶為專一性蛋白酶，活性位點(diǎn)單一，對(duì)蛋白的水解度較小。使用脯氨酸蛋白酶酶解泥鰍蛋白，水解度在不斷增加，在6 h 的水解度達(dá)到2.41%，ACE 抑制率呈先上升后下降趨勢(shì)，在3 h 達(dá)到最大值81.01%。ACE 抑制率受到產(chǎn)生的ACE 抑制肽的含量和抑制活性影響，ACE 抑制率隨著水解度的增加先增加后減小，當(dāng)水解度緩慢變化趨于平穩(wěn)時(shí)具有活性的多肽被水解成高活性或者沒有活性的多肽，所以ACE 抑制率隨之改變。綜上，3 h 為脯氨酸蛋白酶的最佳酶解時(shí)間，此時(shí)水解度為1.48%。

2.2.2 α-胰凝乳蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況

α-胰凝乳蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況見圖2。

圖2 α-胰凝乳蛋白酶酶解泥鰍蛋白過程中水解度和ACE 抑制率的變化Fig.2 Changes of hydrolysis degree and ACE inhibition rate during hydrolysis of loach protein by α-chymotrypsin

由圖2 可見，使用α-胰凝乳蛋白酶酶解大鱗副泥鰍蛋白，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，水解度不斷升高，5 h 達(dá)到最大水解度（9.43%），隨后略有下降。酶解產(chǎn)物的ACE抑制率在未酶解前為31.08%，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，ACE 抑制率呈先上升后下降趨勢(shì)，在4 h 達(dá)到ACE 抑制率最高點(diǎn)（64.91%）。由此可見，水解度最大時(shí)的ACE 抑制率并非最高，表明肽的大小對(duì)其活性的影響非常重要。綜上，4 h 為α-胰凝乳蛋白酶的最佳酶解時(shí)間，此時(shí)水解度為9.04%。

2.2.3 堿性蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況

堿性蛋白酶對(duì)泥鰍蛋白的水解情況見圖3。

圖3 堿性蛋白酶酶解泥鰍蛋白過程中水解度和ACE 抑制率的變化Fig.3 Changes of hydrolysis degree and ACE inhibition rate during the hydrolysis of loach protein by alkaline protease

由圖3 可知，使用堿性蛋白酶酶解泥鰍蛋白，在1 h 之內(nèi)，水解度增加很快，隨著時(shí)間的推移，水解速率下降，5 h 水解度達(dá)到最大值（36.39%）后，水解度幾乎保持不變。酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在2 h 達(dá)到ACE 抑制率最高點(diǎn)（87.84%）。由此可見，肽的大小對(duì)其活性的影響非常重要。綜上，2 h 為堿性蛋白酶的最佳酶解時(shí)間，此時(shí)水解度為28.29%。

比較受試的3 種蛋白酶酶解泥鰍蛋白所得的最高ACE 抑制率，選擇堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶進(jìn)行分步酶解和同步酶解的研究。

2.3 復(fù)合酶解方式產(chǎn)生泥鰍蛋白ACE 抑制肽的情況

2.3.1 雙酶分步酶解泥鰍蛋白的情況

雙酶分步酶解泥鰍蛋白的情況見圖4。

圖4 分步酶解泥鰍蛋白過程中的ACE 抑制率變化Fig.4 Changes of ACE inhibition rate during stepwise enzymatic hydrolysis of loach protein

由圖4 可知，在泥鰍蛋白的2 種分步酶解方式下，ACE 抑制率的變化趨勢(shì)相同，均為先增大后減小。先加堿性蛋白酶酶解2 h 再加入脯氨酸蛋白酶酶解（方式①），ACE 抑制率在2 h 達(dá)到最大值79.17%。先加入脯氨酸蛋白酶酶解3 h 再加入堿性蛋白酶酶解（方式②），ACE 抑制率在4 h 達(dá)到最大值78.24%。兩種分步酶解得到的酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率均低于單一堿性蛋白酶酶解時(shí)的ACE 抑制率（87.84%）。這可能是由于在先后分批加入酶時(shí)，一部分被前一種蛋白酶酶解的有活性的肽段被后加入的酶繼續(xù)酶解成了無活性的肽段。

2.3.2 雙酶同步酶解泥鰍蛋白的情況

雙酶同步酶解泥鰍蛋白的情況見圖5。

由圖5 可知，堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶同時(shí)加入酶解，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率在3 h 達(dá)到最大值90.14%，高于2 種分步酶解方式和3 種單一蛋白酶酶解方式。所以，最佳酶解方式為脯氨酸蛋白酶和堿性蛋白酶同步酶解泥鰍蛋白，最佳酶解時(shí)間為3 h，此時(shí)，酶解液的ACE 抑制率最高IC50為0.491 mg/mL。

圖5 同步酶解泥鰍蛋白過程中的ACE 抑制率變化Fig.5 Changes of ACE inhibition rate during simultaneous enzymatic hydrolysis of loach protein

已有研究表明，卡托普利對(duì)ACE 的IC50為1.30 ng/mL[21]，本研究制備的大鱗副泥鰍蛋白水解物對(duì)ACE 的IC50雖然高于卡托普利，但是，低于LI 等研究的泥鰍的IC50（0.65 mg/mL）[22]。此外，與其它食源性ACE 抑制肽相比，大鱗副泥鰍蛋白水解物的ACE 抑制活性遠(yuǎn)高于小麥水解產(chǎn)物（IC50=2.79 mg/mL）[23]、綠豆蛋白水解產(chǎn)物（IC50=0.69 mg/mL）[24]、高粱蛋白水解產(chǎn)物（IC50=1.96 mg/mL）[25]。相比其它水產(chǎn)源蛋白水解物活性[例如菲律賓蛤仔（IC50=11.68 mg/mL）[26]、馬面魚（IC50=1.35 mg/mL）[27]、阿拉斯加鱈（IC50=11.68 mg/mL）]，大鱗副泥鰍蛋白酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性較高。

2.4 大鱗副泥鰍蛋白水解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果

大鱗副泥鰍蛋白水解產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE見圖6。

圖6 泥鰍蛋白的不同蛋白酶酶解物的Tricine-SDS-PAGEFig.6 Tricine-SDS-PAGE of the hydrolysate of loach protein by different proteases

如圖6 所示，相比于泥鰍蛋白（對(duì)照）的電泳條帶，α-胰凝乳蛋白酶的酶解產(chǎn)物的電泳條帶中，分子量＞31 kDa 的條帶明顯變淺，表明α-胰凝乳蛋白酶將泥鰍蛋白中分子量大于31 kDa 的蛋白質(zhì)酶解；堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物的電泳條帶中，全部的條帶明顯變淺，表明堿性蛋白酶將泥鰍蛋白中大部分蛋白質(zhì)組分酶解；脯氨酸蛋白酶的酶解產(chǎn)物的電泳條帶中，分子量＞31 kDa 的部分條帶消失，分子量位于20.1 kDa～31.0 kDa范圍的條帶消失，分子量位于6.5 kDa～14.1 kDa 范圍的條帶變淺，表明脯氨酸蛋白酶將泥鰍蛋白中分子量位于6.5 kDa～31 kDa 范圍的蛋白質(zhì)組分酶解；復(fù)合酶同步酶解泥鰍蛋白的酶解產(chǎn)物中，分子量大的條帶消失，6.5 kDa 以下分子量的條帶出現(xiàn)。生物活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量通常小于6 000 Da，所以，復(fù)合蛋白酶同步酶解，產(chǎn)生了較大量的具有生物活性的多肽。

復(fù)合蛋白酶的酶解產(chǎn)物ACE 抑制率高于脯氨酸蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制率。說明堿性蛋白酶與脯氨酸蛋白酶兩種酶同時(shí)使用并未互相水解。結(jié)合電泳圖結(jié)果分析，復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物與脯氨酸蛋白酶酶解產(chǎn)物的電泳條帶相比＞14.4 kDa 部分清晰條帶消失，復(fù)合蛋白酶酶解了脯氨酸并未酶解的分子量＞14.4 kDa部分蛋白。堿性蛋白酶的加入水解了大部分大分子蛋白，產(chǎn)生了更多小分子量且以脯氨酸為C 末端的多肽。但是水解產(chǎn)物活性的增加可能是水解出C 末端為疏水性氨基酸的ACE 抑制肽，也有可能是產(chǎn)生了更短且活性更強(qiáng)C 末端為脯氨酸的ACE 抑制肽，需要深入進(jìn)行試驗(yàn)分析。

復(fù)合蛋白酶酶解的酶解產(chǎn)物ACE 抑制率略高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制率。結(jié)合電泳圖結(jié)果分析，堿性蛋白酶將泥鰍蛋白酶解成的小分子多肽在電泳圖中無法顯示。復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物與堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的電泳條帶相比＜14.4 kDa 部分清晰條帶出現(xiàn)，復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物出現(xiàn)了堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物不存在的＜14.4 kDa 部分蛋白。說明堿性蛋白酶與脯氨酸蛋白酶兩種酶同時(shí)使用堿性蛋白酶喪失部分活性。對(duì)比堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物，在復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物出現(xiàn)了6.5 kDa～14.4 kDa 范圍蛋白，這部分蛋白組成是C 末端為脯氨酸或者疏水性氨基酸的多肽。復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性較高，猜測(cè)這部分蛋白ACE 抑制活性較高。ACE 抑制肽的活性和肽鏈長(zhǎng)度有關(guān)，肽鏈越短ACE 活性越高。6.5 kDa～14.4 kDa 蛋白產(chǎn)生的ACE 抑制肽大多是分子量小且末端為疏水性氨基酸的多肽，也可能存在少部分末端為脯氨基酸的ACE 抑制肽。復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物活性高于堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物，說明6.5 kDa～14.4 kDa 這部分蛋白ACE抑制活性更高的應(yīng)是末端為脯氨酸的降血壓肽。猜測(cè)復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)生了更多分子量更小同時(shí)活性更高的以脯氨酸為末端的ACE 抑制肽。

3 結(jié)論

大鱗副泥鰍蛋白含有豐富的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及支鏈氨基酸，是制備ACE 抑制肽的良好來源。大鱗副泥鰍蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶的同步酶解后，水解物具有很高的ACE 抑制活性，IC50為0.491 mg/mL，最適酶解時(shí)間3 h。堿性蛋白酶與脯氨酸蛋白酶的組合，將大分子量的含有脯氨酸末端的肽段水解成了更小分子量的肽段，提高了酶解產(chǎn)物ACE抑制活性。