多廿烷醇抑制高脂飲食動(dòng)物腸道膽固醇吸收的研究

楊倩，湯靜潔，朱艷嬌，黃俊生，孟飛，黃冬婷，項(xiàng)輝*

（1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；3.廣東省綠色制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316）

多廿烷醇（policosanol），是由C20 到C34 等多種飽和一元脂肪醇組成的混合物，主要從甘蔗蠟、蜂蠟、米糠中獲得，從甘蔗蠟提取的多廿烷醇中，二十八烷醇的含量最高，占比約為60%～70%[1-2]。自古巴學(xué)者報(bào)道多廿烷醇可降血脂以來(lái)，許多學(xué)者指出，多廿烷醇能顯著降低血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平，同時(shí)還能升高高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的水平，具有顯著的降脂效用，而且具有良好的耐受性和極高的安全性[3-8]。此外，多廿烷醇還能預(yù)防和治療動(dòng)脈血栓、血管內(nèi)皮功能不良、動(dòng)脈粥樣硬化、間歇性跛行等諸多心血管疾病[9-11]。然而，也有研究者報(bào)道了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中的陰性結(jié)果[12-16]，這引起了人們對(duì)多廿烷醇降脂功能的質(zhì)疑。

血脂異常是造成心血管疾病的主要因素之一，合理應(yīng)用他汀類藥物可以降低膽固醇水平[17-18]，但是許多患者在接受了較大劑量他汀治療后，膽固醇水平仍不能得到有效控制[19]；而且他汀類藥物會(huì)對(duì)部分患者造成肝臟功能和骨骼肌損害，甚至有誘發(fā)骨骼肌溶解導(dǎo)致患者死亡的危險(xiǎn)，此外還有致血糖異常和誘導(dǎo)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[20]。近年來(lái)，膽固醇吸收抑制劑依折麥布作為一種新型調(diào)酯藥物，在治療高膽固醇血癥中發(fā)揮的作用正日益受到關(guān)注[21-22]。受此啟發(fā)，結(jié)合先前的研究，本文探討了多廿烷醇對(duì)腸道膽固醇吸收的影響，進(jìn)一步說(shuō)明其降脂作用效果，并嘗試分析其降脂機(jī)制。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡～6 周齡、7 周齡～8 周齡SPF 級(jí)健康SD 雄性大鼠、5 周齡～6 周齡KM 雄性小鼠：中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，喂食基礎(chǔ)飼料或高脂飼料（配方：蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預(yù)混料0.4%、基礎(chǔ)飼料52.2%），所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)以及中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品、辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照藥：大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜級(jí)）、正己烷（色譜級(jí)）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）、異丙醇（色譜級(jí)）：廣州化學(xué)試劑廠；吐溫80：sigma 公司；多廿烷醇：廣東省科學(xué)院生物工程研究所。由于多廿烷醇極不溶于水，在配制時(shí)，先按照配制體積的10%加入無(wú)水乙醇，沸水浴加熱1 min 使其充分溶解，后加入吐溫80 一滴，充分搖勻，加水至總體積，漩渦振蕩15 min，再超聲30 min，即得多廿烷醇溶液，同時(shí)配制不加多廿烷醇的上述溶液作為溶媒劑（10%乙醇）。

1.3 多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料7 d 小鼠膽固醇吸收的影響

39 只雄性KM 小鼠，22 g～28 g，分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、溶媒組、多廿烷醇低、中、高劑量組，其中前3 組每組6 只，后3 組每組7 只，正常對(duì)照組喂食常規(guī)飼料，其他組連續(xù)喂食高脂飼料7 d。第8 天，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組用生理鹽水灌胃，溶媒組用溶媒劑灌胃，多廿烷醇低、中、高3 組的給藥劑量分別為10、20 mg/kg 和100 mg/kg，灌胃體積均為0.2 mL/10 g。于6、12、18、24 h 收集每組糞便測(cè)定膽固醇含量，收集糞便過(guò)程中動(dòng)物正常喂食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取血測(cè)定總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）指標(biāo)。

1.4 多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料10 d 大鼠膽固醇吸收的影響

雄性SD 大鼠36 只，150 g～180 g，隨機(jī)分成6 組，每組6 只，包括正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、溶媒組和多廿烷醇低、中、高劑量組。除正常對(duì)照組用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余5 組均用高脂飼料喂養(yǎng)，其他條件均一致，飼養(yǎng)10 d。第11 天正常對(duì)照組和模型對(duì)照組用生理鹽水灌胃，溶媒組用溶媒劑灌胃，多廿烷醇低、中、高3 個(gè)劑量組的給藥劑量分別為10、20 mg/kg 和50 mg/kg，灌胃體積均為1 mL/100g。給藥結(jié)束后，以6 h 為單位，收集各組大鼠24 h 糞便測(cè)定膽固醇，給藥后24 h 動(dòng)物不再喂食飼料，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血測(cè)定TC、TG 指標(biāo)。

1.5 多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料30 d 大鼠膽固醇吸收的影響

雄性SD 大鼠30 只，180 g～220 g，隨機(jī)分為6 組，每組5 只，具體的分組、飼養(yǎng)及給藥情況與1.4 一致，在高脂飲食時(shí)同時(shí)進(jìn)行灌胃給藥并持續(xù)30 d。每天稱重，記錄體重變化。給藥期間，每7 d 收集一次每組大鼠一晝夜（24 h）的糞便測(cè)定膽固醇含量，共收集4 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，均按50 mg/kg 劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，下腔靜脈取血，所有血液于常溫（25 ℃）放置20 min，而后3 000 r/min 離心15 min，得新鮮無(wú)溶血血清，測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C 等血脂指標(biāo)。

1.6 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

參照曹曉鋼等的方法處理糞便[23]，具體為將所收集到的糞便進(jìn)行干燥處理，并用研缽將糞便充分碾磨混勻后，準(zhǔn)確稱取200 mg 于15 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇超聲30 min，1 500 r/min 離心15 min，取上清，0.45 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液作為供試品溶液，采用高壓液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定膽固醇濃度，具體條件如下[23]：色譜條件，色譜柱ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶異丙醇（80 ∶20，體積比），檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

采用全自動(dòng)血脂測(cè)試儀對(duì)血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 進(jìn)行測(cè)定。大鼠實(shí)驗(yàn)的血脂測(cè)定由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 測(cè)定結(jié)果

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。膽固醇定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖及樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of cholesterol standard and sample

圖2 膽固醇定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Quantitative standard curve of cholesterol

在HPLC 測(cè)定條件下，對(duì)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分析（圖1 A），得到此色譜條件下的膽固醇保留時(shí)間在10.5 min 左右，再對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析（圖1 B），可以看到目標(biāo)物質(zhì)與膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，且與非目標(biāo)物質(zhì)的分離度良好，證明該條件適合試驗(yàn)樣品的分析，能達(dá)到測(cè)定要求，再對(duì)一系列濃度梯度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品分析之后制得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

此外，在此HPLC 條件下，進(jìn)行以下試驗(yàn)：取某一樣品，每4 h 進(jìn)樣1 次，共進(jìn)樣5 次，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)；選取0.04 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)；準(zhǔn)確稱取大鼠同一份糞便5 份，連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)；取5 份濃度已知的樣品，分別加入等體積0.06 mg/mL 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，陸續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)行加樣回收率測(cè)定試驗(yàn)。膽固醇HPLC 測(cè)定的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，大鼠糞便中膽固醇加樣回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 膽固醇HPLC 測(cè)定的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The HPLC experimental results of stability，precision and reproducibility of cholesterol

表2 大鼠糞便中膽固醇加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 2 The results of recovery rate test of cholesterol in rat feces

從穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)（表1）以及加樣回收率試驗(yàn)（表2）得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)看，儀器性能良好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有很強(qiáng)的可信度。

2.2 多廿烷醇單次給藥對(duì)喂食高脂飼料7 d 小鼠膽固醇吸收的影響

正常喂養(yǎng)的小鼠糞便中含一定量的膽固醇，這與動(dòng)物膽固醇的代謝機(jī)理是一致的。正常情況下，腸道內(nèi)膽固醇75%來(lái)源于膽汁，25%源自食物[21]，動(dòng)物糞便膽固醇一方面來(lái)自飼料中未被吸收的部分，但主要由未被吸收的腸道內(nèi)膽汁產(chǎn)生。多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料7 d 小鼠糞便膽固醇及血脂的影響見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)過(guò)7 d 高脂飼料喂養(yǎng)，糞便膽固醇濃度成10 倍以上增加，而血液中TC 和TG 含量分別增加了83%和34%，說(shuō)明糞便膽固醇的增加主要源于高脂飼料中未被吸收的膽固醇，體現(xiàn)了機(jī)體物質(zhì)代謝平衡的機(jī)制。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，血脂TC、TG 均有顯著增加，說(shuō)明高脂飼料對(duì)動(dòng)物脂肪代謝影響較大。溶媒劑（10%乙醇）在灌胃的12 h 內(nèi)促進(jìn)膽固醇吸收，因此使糞便中膽固醇濃度明顯減少，6 h 和12 h的糞便膽固醇含量?jī)H為模型對(duì)照組的49%和54%，隨著乙醇代謝完畢，該數(shù)值逐漸升高至與模型對(duì)照組相近。與模型對(duì)照組相比，一次灌胃多廿烷醇3 個(gè)劑量均在12 h 內(nèi)增加了膽固醇的排出量，使糞便膽固醇濃度升高，其中6 h 的糞便膽固醇含量分別提升46%（P-10）、35%（P-20）和42%（P-100），12 h 后也有13%～24%的增長(zhǎng)率。與模型對(duì)照組和溶媒組比較，多廿烷醇對(duì)血液中TC 含量未有明顯影響，但中、高劑量組血液中TG 含量顯著降低，表現(xiàn)出一定的降脂作用。

表3 多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料7 d 小鼠糞便膽固醇及血脂的影響Table 3 The effect of policosanol on fecal cholesterol and blood lipid in mice fed high-fat diet for 7 days

2.3 多廿烷醇單次給藥對(duì)喂食高脂飼料10 d 大鼠膽固醇吸收的影響

多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料10 d 大鼠糞便膽固醇及血脂的影響見(jiàn)表4。

正常大鼠糞便中同樣含有一定量的膽固醇（表4），這與小鼠一致。盡管糞便收集是一組一起收集，只有一個(gè)測(cè)定值，但這個(gè)測(cè)定值是一組6 只動(dòng)物產(chǎn)生的，也反映一定的實(shí)驗(yàn)規(guī)律。在利用高脂飼料喂食10 d后，進(jìn)行灌胃給藥，然后禁食來(lái)研究藥物進(jìn)入體內(nèi)后對(duì)于體內(nèi)代謝和排出膽固醇的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了多廿烷醇在一定程度上能夠抑制機(jī)體對(duì)于膽固醇的吸收，促進(jìn)了機(jī)體膽固醇的排泄。無(wú)論是正常對(duì)照組，還是高脂飼料喂食的模型對(duì)照組，在開(kāi)始禁食的18 h內(nèi)，糞便膽固醇含量都是明顯降低的，這與膽固醇停止攝入有關(guān)。24 h 的糞便膽固醇濃度均有升高，而高脂飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物更明顯，說(shuō)明高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致體內(nèi)膽固醇水平升高，排泄到腸道的也增多。對(duì)于高脂飼料喂食10 d 的大鼠，多廿烷醇3 個(gè)劑量組使糞便膽固醇濃度增加，抑制了食物中膽固醇的吸收；與溶媒組相比較，在24 h 時(shí)，P-10、P-20 和P-50 的膽固醇濃度分別升高了60%、81%和123%，這說(shuō)明多廿烷醇也促進(jìn)了體內(nèi)膽固醇的排出。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，多廿烷醇能明顯抑制機(jī)體消化系統(tǒng)對(duì)膽固醇的吸收，也增加了機(jī)體對(duì)膽固醇的排泄。多廿烷醇高劑量組的TC 和TG水平比模型對(duì)照組和溶媒組顯著降低，尤其TG 已達(dá)到正常水平，可能是其對(duì)膽固醇代謝調(diào)節(jié)的結(jié)果。

表4 多廿烷醇對(duì)喂食高脂飼料10 d 大鼠糞便膽固醇及血脂的影響Table 4 The effect of policosanol on fecal cholesterol and blood lipid in rats fed high-fat diet for 10 days

2.4 多廿烷醇連續(xù)給藥對(duì)喂食高脂飼料30 d 大鼠膽固醇吸收的影響

多廿烷醇連續(xù)給藥對(duì)喂食高脂飼料30 d 大鼠糞便膽固醇含量的影響見(jiàn)表5。

表5 多廿烷醇連續(xù)給藥對(duì)喂食高脂飼料30 d 大鼠糞便膽固醇含量的影響Table 5 The effect of continuous administration of policosanol on cholesterol content in feces of rats fed with high-fat diet for 30 days

與2.2 和2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，高脂飼料喂養(yǎng)，使動(dòng)物糞便中膽固醇含量大幅增加，而且隨著高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠糞便膽固醇含量也呈增加的趨勢(shì)，如表5 所示，模型對(duì)照組第4 周比第1 周糞便膽固醇含量明顯增多，增長(zhǎng)量高達(dá)42%。結(jié)合2.2 和2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，到第4 周時(shí)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠糞便膽固醇濃度的增加表明動(dòng)物排泄到腸道的膽固醇也增加了。溶媒組（10%乙醇）的結(jié)果顯示整體上每周24 h 糞便膽固醇濃度都比模型對(duì)照組高，這說(shuō)明10%乙醇對(duì)動(dòng)物膽固醇的代謝影響很大，糞便中膽固醇增加是機(jī)體膽固醇水平升高的結(jié)果。此外，發(fā)現(xiàn)多廿烷醇3 個(gè)劑量組中，糞便膽固醇含量大多數(shù)在溶媒組和模型對(duì)照組之間，一方面說(shuō)明多廿烷醇對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)動(dòng)物脂肪代謝有一定調(diào)節(jié)作用，另一方面也說(shuō)明多廿烷醇對(duì)乙醇影響膽固醇水平的作用有一定影響。

大鼠血脂四項(xiàng)水平見(jiàn)表6。

表6 大鼠血脂四項(xiàng)水平Table 6 The level of four blood lipids items mmol/L

30 d 后取血測(cè)定的血脂四項(xiàng)的結(jié)果大體上與糞便膽固醇測(cè)定結(jié)果相符。與正常對(duì)照組相比（表6），模型對(duì)照組血脂TC 和LDL-C 水平顯著升高，分別增加78%和335%，而HDL-C 水平降低了17%，表明高脂飼料影響了機(jī)體的脂肪代謝。而溶媒組（10%乙醇）與模型對(duì)照組比較，盡管血脂四項(xiàng)水平同樣處于異常，但幾項(xiàng)指標(biāo)沒(méi)有顯著性差別，這可能與溶媒組動(dòng)物有較高的膽固醇排出量有關(guān)，但這個(gè)機(jī)制尚不明確。與溶媒組相比，多廿烷醇3 個(gè)劑量組LDL-C 水平有下降，但在目前樣本量下沒(méi)有顯著性差別，綜合血脂TC 和HDL-C 結(jié)果來(lái)看，多廿烷醇對(duì)脂肪代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。

3 討論與結(jié)論

古巴學(xué)者的系列研究證明多廿烷醇具有極好的降脂作用，且沒(méi)有明顯的副作用，被譽(yù)為“血管的清道夫”，加之具有來(lái)源廣、低成本的特點(diǎn)，多廿烷醇已經(jīng)被作為第五大降脂藥物應(yīng)用于臨床。隨著研究增加也出現(xiàn)了一些陰性結(jié)果，例如，美國(guó)[12]和德國(guó)[16]進(jìn)行的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)，分別以40 例和143例高血脂癥患者為研究對(duì)象，分成口服多廿烷醇20、40 mg/d 和80 mg/d 劑量和安慰劑8 周～12 周，結(jié)果顯示，治療組與對(duì)照組間血脂TC、TG 和HDL 水平變化無(wú)顯著性差異。為了進(jìn)一步明確多廿烷醇的效果，為臨床應(yīng)用提供明晰的依據(jù)，本文從機(jī)體的膽固醇代謝入手來(lái)探討多廿烷醇的作用。

動(dòng)物機(jī)體（包括人）血液中膽固醇主要來(lái)源于肝臟與外周組織生物合成的內(nèi)源性膽固醇和食物的腸道吸收外源性膽固醇[21]。機(jī)體膽固醇的生物合成與腸道吸收處于一種代償平衡，生物合成受抑制時(shí)，吸收會(huì)增加，反之亦然。本文通過(guò)高脂飼料分別喂養(yǎng)小鼠7 d、大鼠10 d 和30 d，均顯著增加了動(dòng)物糞便膽固醇排出量，也顯著增加了血脂水平。高脂飼料會(huì)大大促進(jìn)食物中脂肪和膽固醇被動(dòng)物吸收進(jìn)入機(jī)體，導(dǎo)致血液TC 和TG 升高，而血液TC 水平上升后也會(huì)增加膽固醇的排出量，因此食物中未被吸收的膽固醇和膽汁排出的膽固醇都會(huì)使糞便膽固醇量增加。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇與高脂飼料同時(shí)存在，可促進(jìn)動(dòng)物對(duì)膽固醇的吸收，也許因?yàn)槠胶獾臋C(jī)制，膽固醇的排出也會(huì)增加。

在高脂喂食7 d 小鼠實(shí)驗(yàn)和10 d 大鼠實(shí)驗(yàn)中，多廿烷醇能顯著地增加動(dòng)物膽固醇的排泄量，既能抑制膽固醇的吸收，也能增加高血脂大鼠對(duì)膽固醇的排出，這揭示多廿烷醇能對(duì)機(jī)體膽固醇的代謝產(chǎn)生影響。高脂喂食30 d，與溶媒組比較，多廿烷醇組膽固醇的排泄量減少，這可能是其通過(guò)其他機(jī)制降低了血液膽固醇水平，而使機(jī)體通過(guò)膽汁排泄膽固醇減少。結(jié)果表明多廿烷醇能發(fā)揮降脂作用，機(jī)制之一就是對(duì)膽固醇代謝的影響。

綜上所述，多廿烷醇具有一定的降脂作用，其降脂作用既可能與抑制膽固醇腸道吸收、調(diào)節(jié)膽固醇的代謝有關(guān)，也可能存在其他機(jī)制來(lái)降低血脂水平。