液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測飼料中26種磺胺和3種磺胺增效劑

■宋占騰 肖志明 王 石 樊 霞 索德成

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081)

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是一類用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的抗生素[1]。1935年磺胺類藥正式應(yīng)用于臨床。具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、體內(nèi)分布廣等優(yōu)點?；前奉愃幬镌谛竽翗I(yè)，被廣泛用于治療食源性動物疾病，同時可以添加到飼料中作為預(yù)防和促生長使用[2-4]?；前吩鲂?sulfonamide potentiators,SAP)是指含有5-取代芐基-2，4-二氨基嘧啶的一類化合物，包括三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧芐胺嘧啶和二甲氧甲基芐胺嘧啶等，多與磺胺合用使細(xì)菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，可以增加磺胺抗菌作用?；前吩鲂┡c磺胺聯(lián)合使用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中治療大腸桿菌引起的敗血癥、雞白痢及球蟲病等[4-6]。但是近年研究表明, 該類藥物存在較為嚴(yán)重的副作用, 過量使用會導(dǎo)致其在動物源性食品中殘留，會致使其在人體中蓄積，導(dǎo)致人類對許多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，從而對人類的身體健康造成很大的危害[7～9]。因此，很多國家對磺胺種類的使用和用量有嚴(yán)格的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定動物源性食品中的SAs 總量及磺胺二甲基嘧啶等單個SAs的含量不得超過0.1 mg/kg，磺胺增效劑限量不得超過0.05 mg/kg[10]。由于抗生素潛在的威脅，美國FDA從2017年開始禁止在牲畜飼料中使用預(yù)防性抗生素[11。2019 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194 號公告，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，磺胺和其增效劑正式在飼料中禁用[12]。作為常用的抗生素，飼料中磺胺和磺胺增效劑的測定技術(shù)是必不可少的。

國內(nèi)外對磺胺類藥物和增效劑的文獻報道較多。主要有高效液相色譜法(HPLC)[13-17]、酶免疫分析法(EIA)[18-22]、液/質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)[23-30]等。目前文獻報道涉及的樣品主要以動物組織和環(huán)境樣品為主[15-32]，對飼料的檢測報道相對較少。目前有關(guān)飼料中磺胺類藥物檢測方法標(biāo)準(zhǔn)主要包括《飼料中磺胺類藥物的測定—高效液相色譜法》（GB/T 19542—2007）和《飼料中9 種磺胺類藥物的測定 高效液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部1486 號公告-7-2010），檢測儀器主要集中以高效液相色譜法為主，檢測靈敏度低，無法作為確證檢測技術(shù)，并且分析的藥物覆蓋面窄，不能滿足現(xiàn)今磺胺類藥物的監(jiān)測要求。目前現(xiàn)有的磺胺類檢測方法存在樣品處理方法繁雜、費時、成本高等問題，不利于實現(xiàn)快速、簡便、高通量、低成本篩查。同時目前尚缺磺胺類藥物與磺胺增效劑的同步測定方法。為此，本文在查閱有關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，建立了多重機制雜質(zhì)吸附結(jié)合LC-MS/MS 同時檢測和確證飼料中26 種磺胺及3 種磺胺增效劑的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters TQS 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀[帶有電噴霧電離源(ESI 源)]，購于美國Waters 公司；Waters BEH C18 色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters CSH C18 色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters TSS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），購于美國Waters 公司。前處理吸附材料Cleanert S C8：粒徑50 μm；Cleanert S C18：粒徑50 μm；Cleanert S硅藻土（SLE）：粒徑150 μm；Cleanert S 中性氧化鋁（Al-N）：粒徑150 μm；Cleanert S 活性炭（Carb）：粒徑120～400 mesh；Cleanert S納米碳Nano Carb：粒徑10～20 nm，均購于博納艾杰爾科技公司。吸附材料BONDESILSAX：粒徑40 μm；BONDESIL-SCX：粒徑40 μm；BONDESIL-NH2：粒徑40 μm；BONDESIL-FL：粒徑200 μm；均購于安捷倫科技公司。磺胺類藥物及磺胺增效劑分別購于Dr. Ehrenstorfer(Augsberg，Germa?ny)、Sigma-Aldrich(Luckenwalde，Germany)、Manhage Bio-technology Company(Beijing，China)、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（Beijing，China）。甲酸（色譜純，Sigma 公司）；乙腈和甲醇（色譜純，F(xiàn)isher ChenAlert Guide 公司）；其他試劑均為分析純試劑，試驗用水為Mili-Q純化后的超純水（＞18 MΩ）。0.22 μm 聚四氟乙烯(PT?FE)濾膜購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

多重吸附前處理吸附材料:稱取2 g BONDESILSAX、3 g Cleanert S C18、3 g BONDESIL-FL 于50 mL三角瓶中，混合均勻，備用。

1.2 樣品前處理

稱取飼料樣品5 g（精確至0.01 g），加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，超聲提取30 min，以10 000 r/ min離心5 min。取上清液備用。

取3 mL上清液于10 mL離心管中，加入100 mg多重吸附前處理吸附材料，漩渦混合30 s，于10 000 r/min離心2 min。將2 mL 上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，40 ℃氮氣吹干，加入0.5 mL甲醇+0.1%甲酸溶液（10+90），漩渦混合30 s，過0.22 μm濾膜，上LC-MS/MS測定。若樣品中含量超出線性范圍，用樣品稀釋液稀釋至線性范圍內(nèi)上樣。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters CSH C18 柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）；柱溫25 ℃；進樣量5 μL；流動相流速為0.3 mL/min，梯度淋洗，流動相組成和梯度見表1。

質(zhì)譜采用電子噴霧離子源，正離子檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（HRM）；噴霧電壓為3.5 kV；毛細(xì)管溫度為550 ℃；脫溶劑氣為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。具體的參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

參考文獻，本試驗中比較了3種具有不同選擇性的UPLC 色譜柱Waters BEH C18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)、Waters HSS T3 C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Waters CSH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）進行分離比較。其中HSS T3 C18 分離效果較差；BEH 對磺胺米隆無保留，同時飼料中一些雜質(zhì)對部分磺胺類藥物有干擾，部分磺胺類藥物峰型拖尾。因此采用Wa?ters CSH C18柱克服了大多數(shù)C18柱在低離子強度流動相條件下因載量所導(dǎo)致的拖尾問題。提高了有效的提高了磺胺類藥物和增效劑分辨率。

大部分液相色譜檢測磺胺類藥物和其增效劑均采用以甲醇/乙腈+甲酸水/醋酸水體系作為基本流動相條件，本試驗考察了磺胺類藥物和其增效劑在上述流動相梯度條件下的色譜行為。結(jié)果表明：乙腈和水溶液作為流動相時，三種同分異構(gòu)的磺胺類藥物（磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶）和兩種同分異構(gòu)的磺胺類藥物（磺胺胍、磺胺醋酰）無法通過調(diào)節(jié)梯度達到滿意的分離效果，因此選擇了0.1%甲醇和0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相。同時通過梯度洗脫，可以在10 min內(nèi)有效分離29種藥物，縮短了保留時間，在很大程度上節(jié)省了溶劑消耗，降低了分析成本和廢液產(chǎn)生。同時明顯提高了分離效應(yīng)，有效縮短了分析周期，具體色譜圖見圖1。同時為了避免干擾，采取分段采集的方式，有效的提高靈敏度和雜質(zhì)干擾。

表1 流動相梯度條件

表2 磺胺和磺胺增效劑的質(zhì)譜條件

表2（續(xù)） 磺胺和磺胺增效劑的質(zhì)譜條件

2.2 提取條件選擇

磺胺類藥物和其增效劑的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異不大，根據(jù)文獻，有機溶劑（乙腈、甲醇）提取各種類型磺胺類藥物和其增效劑有較好的回收率，王恒等[17]研究了7 種提取液對動物源性食品中磺胺類藥物的提取效率，結(jié)果基本無差異。但雜質(zhì)提取量有所區(qū)別，乙腈類的提取效果好于乙酸乙酯的提取效果，二氯甲烷是最好的提取溶劑。為了獲得盡可能高的回收率，本試驗分別選用甲醇、乙腈、水/乙腈、二氯甲烷作為提取溶劑。以二氯甲烷作為提取液提取時，飼料中大量脂溶維生素被二氯甲烷提出從而影響了藥物回收率。甲醇提取雜質(zhì)較高，下一步凈化效果不明顯。綜合考慮，選擇了乙腈作為提取液。同時，發(fā)現(xiàn)在乙腈中加入一定量的甲酸能提高磺胺增效劑的回收率，同時甲酸可使磺胺類藥物和其增效劑在酸性條件下更易形成正離子，有利于質(zhì)譜分析。為此最終選擇20 mL 1%甲酸乙腈溶液作為提取溶液。

2.3 多重機制雜質(zhì)吸附凈化的條件選擇

選擇磺胺和磺胺增效劑與10 種吸附材料（具體見表3）進行了吸附性能研究試驗。具體步驟如下：取配合飼料25 g，加入100 mL 提取液，離心，將上清液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，分別吸3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL 磺胺和其增效劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入100 mg各種吸附材料，漩渦混合30 s,在搖床上振蕩15 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液過膜，上機檢測，同時吸取3 mL 提取液，不加入吸附材料作為空白參考。用測定值與空白參考值計算回收率。

吸附結(jié)果見圖2，雖然部分吸附材料對某些磺胺類藥物和其增效劑有明顯的吸附（回收率小于10），但是其對磺胺類藥物和增效劑吸附率不能達到100%，無法作為富集材料使用。同時我們沒有發(fā)現(xiàn)一種洗脫液能有效洗脫吸附在材料上的磺胺類藥物和其增效劑。然而，從圖2可以看出吸附材料能吸附大量干擾物質(zhì)，降低了基質(zhì)效應(yīng)。使處理后回收率高于空白提取液。因此，最終采用多重機制雜質(zhì)吸附技術(shù)(multi-function impurity adsorption cleaning，MIA)來凈化樣品。多重機制雜質(zhì)吸附技術(shù)是一種最新提出的基于介質(zhì)分散固相萃取的方法，該方法主要通過選擇多種功能化吸附材料，將樣品中的主要干擾雜質(zhì)吸附，有效地去除基體中可能存在的磷脂、色素等物質(zhì)，同時將被測物質(zhì)留在樣品溶液中，而達到凈化和富集的目的，可大大節(jié)省樣品前處理的時間。從吸附機理上來看，C8 和C18是主要靠非極性碳鍵相互作用，有助于對非極性吸附過程的樣品的洗脫反相萃取，主要吸附于磷脂和中等極性的化合物, 由于C8 碳鍵較C18短，所以吸附雜質(zhì)能力弱于C18，因此選擇了C18作為候選材料；氨基（NH2）是硅膠基質(zhì)上鍵合極性氨基丙基的極性吸附劑，而且同時具有氫鍵和陰離子交換兩種作用機理，可用于從極性樣品當(dāng)中分離其非極性分化合物；SAX為硅膠上鍵合鹵化季銨鹽的吸附劑；與NH2吸附機理相似，相比NH2，SAX吸附雜質(zhì)效果更好。弗洛里硅土為硅膠鍵合氧化鎂的吸附劑，主要用于去除部分色素和大分子物質(zhì)。因此選擇C18，弗洛里硅土，SAX作為多重機制雜質(zhì)吸附材料，通過混合使用可以有效的去除飼料中各種雜質(zhì)干擾，達到更好的凈化效果。將各種材料按不同比例添加進行凈化研究，從基質(zhì)凈化效果來，SAX、弗洛里硅土和C18 的比例為2∶2∶3，能有效地吸附雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。

圖1 29種磺胺類藥物和磺胺增效劑色譜圖（1.標(biāo)準(zhǔn)樣品；2.空白飼料樣品；3.飼料添加回收）

同時考察了吸附材料的使用量對凈化效果的影響，比較了10、20、50、100、200、500 mg 不同固體吸附劑加入量對3 mL 飼料提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達100 mg時，繼續(xù)加大吸附劑的用量對飼料樣品雜質(zhì)的凈化效果和回收率無明顯改善。因此將吸附材料加入量設(shè)定為100 mg。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，可以有效地除去基質(zhì)中的干擾物對待測物色譜峰的影響，同時減少雜質(zhì)對儀器和色譜柱的損害。

表3 吸附材料名稱與類型

圖2 不同吸附劑對磺胺和磺胺增效劑吸附能力比較（以回收率作為參考）

2.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和檢出限、定量限

不同飼料樣品的組成比較復(fù)雜，液質(zhì)檢測藥物時基質(zhì)干擾非常明顯。取空白飼料樣品進行前處理，以此基質(zhì)提取液作稀釋液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與直接用定容液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液對比，大部分磺胺藥物表現(xiàn)基質(zhì)抑制。為消除基質(zhì)效應(yīng)，本試驗繪制基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線來進行定量。分別取不同基質(zhì)的空白樣品進行前處理后，配置濃度為1～500 μg/L 磺胺類藥物（磺胺胍、磺胺醋酰和磺胺為5 μg/L）和磺胺增效劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液終濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性試驗結(jié)果見表4，可見標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～100 μg/L 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（磺胺胍、磺胺醋酰和磺胺為5.0～500 μg/L）。依據(jù)定量離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3為檢出限(LOD)，S/N大于10為定量限(LOQ)，得出29種藥物的LOD和LOQ。

2.5 回收率試驗

精密稱取空白配合飼料與濃縮飼料樣品5 g，添加不同量磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液制成含50、200、1 000 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)的樣品，按上述方法進行檢測，每個樣品5 個重復(fù)，測的回收率和變異系數(shù)見表5。由表5 可知，在50、200、1 000 μg/kg添加水平，該方法回收率為63.4%～110.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。典型的飼料空白色譜圖和添加回收率色譜圖見圖1和圖2。

3 結(jié)論

本研究建立了多重機制雜質(zhì)吸附結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測飼料中26 種磺胺及3 種常用磺胺增效劑的方法。通過對提取溶劑、凈化等前處理條件及LC-MS/MS分析條件的優(yōu)化，該方法可同時檢測飼料中29 種磺胺類藥物及其增效劑。本方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高等優(yōu)點，適合于飼料中磺胺

類藥物及其增效劑的監(jiān)測。

表4 磺胺和磺胺增效劑線性方程

表5 添加回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)(recovery±RSD，%)