慢性前列腺炎模型篩選及其腎功能評(píng)價(jià)

王文地，鄭玉婷，于冰莉，崔 潔，侯俊玲，3*，王文全，，3*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488)

慢性前列腺炎(CP)在成年男性中的患病率接近50%[1]，臨床表現(xiàn)為盆腔或生殖器疼痛、下尿路刺激和梗阻癥狀、精子質(zhì)量降低等[2-5]。國(guó)內(nèi)外研究者已建立的CP模型有微生物致病模型、化學(xué)刺激模型、免疫誘導(dǎo)模型、激素誘導(dǎo)模型和老齡動(dòng)物自發(fā)模型等[6]。其中化學(xué)刺激模型操作方便，在國(guó)內(nèi)外研究中使用廣泛。

1 儀器與材料

1.1儀器 3K15型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；FA2004N型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；120型全自動(dòng)生化儀(日本東芝公司)；TEK-Ⅱ mini型血細(xì)胞分析儀(江西特康公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2試藥 角叉菜膠(批號(hào)1202A053)，北京索萊寶科技有限公司；消痔靈注射液(批號(hào)18103006，規(guī)格：10 mL∶0.4 g)，吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司；注射用青霉素鈉(批號(hào)180601)，華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司；氯化鈉注射液(批號(hào)SD19091407，規(guī)格：500 mL∶4.5 g)，山東華魯制藥有限公司；尿素氮、肌酐和葡萄糖(批號(hào)分別為20190701、20190901、20190901)，均購(gòu)自北京北檢新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司。試劑盒：前列腺特異性抗原(PSA)，前列腺素E-2(PGE-2)，γ干擾素(IFN-γ)，白細(xì)胞介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號(hào)分別為20190609-30702A、20190609-30581B、ml064291、ml064292、ml002859)，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。中性甲醛溶液(批號(hào)20181212)，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；水合氯醛(批號(hào)20181017)，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為280～320 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)在(22±2) ℃、相對(duì)濕度為55%±5%的層流氣流室中，每12 h交替明暗，標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水，于常規(guī)條件下適用性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.12種造模方法穩(wěn)定性比較實(shí)驗(yàn) 將24只SD雄性大鼠適用性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，分別為假手術(shù)組、角叉菜膠組和消痔靈組，每組8只，分籠喂養(yǎng)。在造模手術(shù)當(dāng)天腹腔注射100 g·L-1的水合氯醛3 mL·kg-1，待大鼠麻醉后于下腹縱向開(kāi)約1 cm切口，暴露膀胱背側(cè)前列腺及精液囊。假手術(shù)組大鼠立即縫合肌肉皮膚；角叉菜膠組大鼠給予10 g·L-1角叉菜膠生理鹽水，按照每只每側(cè)0.05 mL注入兩側(cè)精液囊內(nèi)，縫合肌肉皮膚；消痔靈組大鼠給予消痔靈注射液，按照每只每側(cè)0.06 mL注入大鼠前列腺兩背側(cè)葉，縫合肌肉皮膚。術(shù)后各組大鼠按照劑量25萬(wàn)u·kg-1肌肉注射青霉素，每日1次，連續(xù)3 d。所有大鼠造模術(shù)后連續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)7周，每周測(cè)量體質(zhì)量并記錄。在術(shù)后第1、3、5周禁食12 h后眼眶采血，術(shù)后第7周禁食12 h后腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠，仔細(xì)采集前列腺、腎、睪丸、脾和胸腺。計(jì)算各臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。所有血樣靜置2 h后以4 000 r·min-1離心10 min，收集血清，于-80 ℃儲(chǔ)存，根據(jù)PSA、PGE-2的Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組大鼠血清中各指標(biāo)的含量。

2.2角叉菜膠致大鼠CP模型評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn) 將16只SD雄性大鼠適用性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組和角叉菜膠組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。角叉菜膠組與2.1項(xiàng)下角叉菜膠組造模方法一致。在術(shù)后第1、3周禁食12 h后眼眶采血，術(shù)后第5周禁食12 h后腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠并采集前列腺及腎，計(jì)算臟器指數(shù)。采集的全血樣本，用三分類(lèi)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組大鼠全血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)。血清根據(jù)PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ的Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組大鼠血清中各指標(biāo)含量，并用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中CREA、UREA和GLU的含量。

3 結(jié)果

3.12種造模方法維持時(shí)間比較 本文對(duì)角叉菜膠組和消痔靈組模型進(jìn)行了比較研究，以PSA和PGE-2為指標(biāo)，對(duì)比造模后各時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)水平，見(jiàn)表1。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，炎性因子PGE-2表達(dá)升高，促進(jìn)血管擴(kuò)張，使毛細(xì)血管的通透性增大，引起疼痛等癥狀。同時(shí)，由于生理屏障被破壞，PSA大量進(jìn)入血液循環(huán)中[15-16]。由表1可知，角叉菜膠組血清PSA及PGE-2水平造模后第1、3、5周均顯著高于假手術(shù)組，造模后第7周，PSA及PGE-2水平與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，角叉菜膠組造模完成后1周即可顯現(xiàn)血清炎癥現(xiàn)象，第7周血清炎癥恢復(fù)正常，該模型維持時(shí)間至少4周。

表1 2種模型的檢測(cè)指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of detection indexes between the 2 models

消痔靈組血清PSA及PGE-2水平在造模術(shù)后第1周與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在造模后第3周PSA及PGE-2水平與假手術(shù)組比較顯著升高，在造模后第5周血清PSA水平仍顯著高于假手術(shù)組，而血清PGE-2水平與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PSA及PGE-2水平在造模術(shù)后第7周與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明消痔靈組造模完成3周后造模成功，第5周起血清炎癥情況逐漸恢復(fù)，該模型至少能維持2周。

造模手術(shù)后第7周臟器指數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，角叉菜膠組和消痔靈組的前列腺指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，對(duì)各組腎、睪丸、脾和胸腺指數(shù)進(jìn)行分析，2組與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明2種造模方法對(duì)前列腺指數(shù)有顯著升高的作用，維持時(shí)間較長(zhǎng)，但對(duì)其他臟器影響均較小，且角叉菜膠組模型成模時(shí)間更早，維持時(shí)間更長(zhǎng)。

3.2角叉菜膠致大鼠CP模型評(píng)價(jià)

3.2.1相關(guān)炎癥因子考察 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)中角叉菜膠誘導(dǎo)模型維持時(shí)間結(jié)果及對(duì)前列腺炎治療藥物相關(guān)研究中灌胃時(shí)間的綜合考慮，取造模后第5周的大鼠，檢測(cè)其他相關(guān)炎癥因子，見(jiàn)表2。TNF-α和IFN-γ是促炎性細(xì)胞因子，均由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，前者刺激白細(xì)胞合成白細(xì)胞介素1 (IL-1)、IL-6和白細(xì)胞介素8 (IL-8)等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；后者促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活化[17]。WBC常用來(lái)間接反映炎癥的嚴(yán)重程度，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，白細(xì)胞分泌釋放IL-6，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖[18-19]。

表2 角叉菜膠誘導(dǎo)模型相關(guān)炎癥因子檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of the inflammation related indexes of carrageenan-induction model

由表2可知，角叉菜膠組WBC結(jié)果顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，血清中炎癥相關(guān)因子PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均顯著提高。對(duì)前列腺指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，角叉菜膠組大鼠前列腺指數(shù)高于假手術(shù)組，表明該模型能引起相關(guān)炎癥因子表達(dá)量升高，且能維持到造模后第5周。角叉菜膠組腎指數(shù)與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2.2腎功能影響檢測(cè) 對(duì)造模后不同時(shí)期的各組大鼠血清中腎功能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，分析造模對(duì)大鼠腎功能的影響趨勢(shì)，見(jiàn)表3。由表3可知，造模后第1周，角叉菜膠組血清CREA及GLU水平與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UREA水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；造模后第3周，角叉菜膠組大鼠CREA水平與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UREA水平顯著高于假手術(shù)組，GLU水平顯著低于假手術(shù)組；造模后第5周，角叉菜膠組大鼠3個(gè)腎功能因子水平與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該模型造模后對(duì)大鼠血清中CREA水平無(wú)影響，在造模后第1、3周UREA均升高，在造模后第5周，該影響恢復(fù)至正常水平；對(duì)于GLU水平，角叉菜膠組在造模后第3周顯著低于假手術(shù)組，造模后第5周差異恢復(fù)。

表3 角叉菜膠誘導(dǎo)模型腎功能影響檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of renal function of carrageenan-induction model

4 討論

CP作為一種慢性病，病程纏綿，治療周期長(zhǎng)，該疾病帶來(lái)的疼痛和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)對(duì)患者的心理狀態(tài)和生活質(zhì)量產(chǎn)生極大影響[20-22]。研究CP動(dòng)物模型作為進(jìn)行相關(guān)治療研發(fā)的基礎(chǔ)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[23]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)化學(xué)刺激模型中常用的2種致炎劑誘導(dǎo)模型的穩(wěn)定性進(jìn)行了對(duì)比。與假手術(shù)組比較，角叉菜膠組從造模后第1周起PSA與PGE-2水平顯著提高(P<0.05)，造模后第7周恢復(fù)至假手術(shù)組水平(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，消痔靈組從造模后第3周開(kāi)始PSA與PGE-2水平顯著提高(P<0.05)，其中PSA在第7周恢復(fù)至假手術(shù)組水平(P>0.05)，PGE-2在造模后第5周與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？紤]到消痔靈與角叉菜膠注射液質(zhì)地不同，吸收程度和在組織內(nèi)作用快慢存在差異，消痔靈誘導(dǎo)該模型成模時(shí)間較角叉菜膠晚，維持時(shí)間短，因此認(rèn)為角叉菜膠造大鼠CP模型更優(yōu)。

造模后第7周取材各臟器，角叉菜膠組和消痔靈組前列腺指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，其他臟器指數(shù)兩模型組與假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)兩模型組前列腺指數(shù)在第7周未降低至假手術(shù)組水平，考慮可能是由于炎癥導(dǎo)致前列腺組織纖維化難以在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。其他各臟器指數(shù)在造模后第7周時(shí)與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮是否在造模期間產(chǎn)生差異，第7周時(shí)恢復(fù)的可能。本文結(jié)合臨床上CP與慢性腎臟病間出現(xiàn)的特點(diǎn)[24-25]，考慮到腎臟作為多種藥物或其代謝產(chǎn)物濾過(guò)、重吸收和排泄的場(chǎng)所[26]，在藥物篩選中腎毒性多作為重點(diǎn)考慮的研究對(duì)象，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠CP模型中各時(shí)間點(diǎn)的腎功能指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)[27]。結(jié)果表明，造?？缮哐錟REA(P<0.05)，降低GLU(P<0.05)，但在造模后第5周檢測(cè)該影響消失，且腎指數(shù)也與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，灌胃第4周可作為藥物篩選和藥物腎毒性考察的綜合考量點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)可為CP與慢性腎臟病結(jié)合的臨床病理綜合征的模型研究奠定基礎(chǔ)，并對(duì)基于動(dòng)物模型的藥物腎毒性考察中給藥周期的確定提供理論依據(jù)。