網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接技術(shù)探討白藥子抗肺癌的作用機(jī)制

孫杏倩，田 璟，2，梅佳華，普 娟，高家菊，馬云淑，3*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500；2.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，昆明 650500；3.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500)

白藥子是傳統(tǒng)中藥，別名金線吊烏龜，為防己科植物金線吊烏龜(StephaniacepharanthaHayata)的干燥塊根，最早以“白藥”之名記載于《新修本草》[1]?！兜崮媳静荨份d“白藥子，味微苦，性平。入脾、肺、腎三經(jīng)。主治補(bǔ)中益氣，斂肺氣，興陽道，治陽痿，止虛勞咳嗽，傷風(fēng)日久咳嗽，良效”[2]。白藥子所含化學(xué)成分主要為生物堿，包括小檗堿、異紫堇定堿、克班寧、罌粟堿、可待因和頭花千金藤堿等[3-4]。白藥子具有抗癌、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗菌消炎、增強(qiáng)免疫、逆轉(zhuǎn)耐藥和抗心律失常等藥理作用。前期研究表明，白藥子提取物可通過促進(jìn)骨髓造血而產(chǎn)生提升白細(xì)胞數(shù)量的作用[5]。白藥子活性成分千金藤素能夠抑制A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，是通過抑制miR-150和miR-182分別下調(diào)抑癌基因腫瘤蛋白p53和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)的表達(dá)[6]。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，千金藤素可能會(huì)成為一種新型的自噬抑制劑[7]?？税鄬幰餐ㄟ^阻斷核因子κB (NF-κB)、調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡并抑制其侵襲[8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體、系統(tǒng)和高效的特點(diǎn)，能對(duì)“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的相互關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的研究，在藥物研究中被廣泛應(yīng)用[9]。因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討白藥子所含主要化學(xué)成分的抗腫瘤作用機(jī)制，重點(diǎn)分析在肺癌治療中的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

1 材料和方法

1.1白藥子化學(xué)成分的收集及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)是中草藥的系統(tǒng)藥理平臺(tái)，利用萬方、維普、知網(wǎng)及PubMed等挖掘檢索白藥子的所有化學(xué)成分及靶點(diǎn)。以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18篩選有效化合物，檢索結(jié)果用 Excel收集，建立靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.2肺癌靶點(diǎn)的獲取及收集 本研究使用Gene Cards數(shù)據(jù)庫，通過輸入關(guān)鍵詞“l(fā)ung cancer”獲取與肺癌相關(guān)的靶標(biāo)基因。由于以上腫瘤基因相關(guān)數(shù)量太多，因此在收集數(shù)據(jù)時(shí)需過濾部分?jǐn)?shù)據(jù)，設(shè)置相關(guān)性評(píng)分限制≥5分，獲得白藥子與肺癌之間的潛在靶點(diǎn)。

1.3“白藥子-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用Cytoscape v3.7.2軟件將白藥子活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和肺癌的靶點(diǎn)基因進(jìn)行匹配，獲得兩者的共同基因，進(jìn)行擴(kuò)展分析，從而構(gòu)建“白藥子-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用STRING數(shù)據(jù)庫，將白藥子的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)是蛋白質(zhì)，邊緣表示預(yù)測(cè)的功能關(guān)聯(lián)，根據(jù)視圖設(shè)置繪制邊。在證據(jù)模式下，不同顏色的直線表示不同的相互作用關(guān)系證據(jù)來源。在置信度模式下，線的粗細(xì)表示交互的置信度預(yù)測(cè)程度[10]。

1.5活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接 以白藥子活性成分以及目前已報(bào)道的有效藥物作為配體，應(yīng)用PubChem數(shù)據(jù)庫(查找7個(gè)活性成分的三維結(jié)構(gòu)，下載化合物 MOL 結(jié)構(gòu)式作為配體，通過STRING數(shù)據(jù)庫查找核受體共激活劑2(NCOA2)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作為受體。CB-Dock網(wǎng)站可以預(yù)測(cè)給定蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，并使用基于曲率的新型腔檢測(cè)方法來計(jì)算中心和大小，并與對(duì)接程序Autodock Vina進(jìn)行對(duì)接[11]。

1.6關(guān)鍵靶點(diǎn)基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO生物過程分析及KEGG通路富集分析，并構(gòu)建柱狀圖、氣泡圖及通路圖。

2 結(jié)果

2.1白藥子活性成分的潛在作用靶點(diǎn)、潛在疾病的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索的白藥子化學(xué)成分共25個(gè)，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)方法設(shè)置以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為指標(biāo)[12]，篩選得到潛在的6個(gè)活性成分，見表1。

表1 白藥子潛在活性成分信息Tab.1 Information of potential active ingredients of Baiyaozi

2.2白藥子成分抗癌的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，檢索“l(fā)ung cancer”并篩選相關(guān)性評(píng)分限制≥5的基因，其中得到肺癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌等疾病的潛在靶點(diǎn)4 065個(gè)，利用R預(yù)言繪制維恩圖，其中白藥子活性成分共有43個(gè)，白藥子與肺癌相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因有29個(gè)。

2.3“白藥子-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 見圖1。由圖1可知，在Cytoscape v3.7.2軟件的可視化中，通過29個(gè)靶點(diǎn)(綠色)、6個(gè)活性成分(淺藍(lán)色)、1個(gè)疾病(紅色)和1個(gè)藥物(黃色)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。白藥子成分中靶點(diǎn)數(shù)量最多的前3種活性成分為(S)-(6-甲氧基-4-喹啉)-[(2S，4S，5S)-5-乙烯基奎寧環(huán)-2-基]甲醇、罌粟堿和異紫堇定堿，分別靶向26、18、16個(gè)靶基因，提示中藥多成分-多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 “白藥子-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of "Baiyaozi-active ingredients-key targets"

2.4關(guān)鍵靶點(diǎn)基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 將白藥子抗肺癌治療的29個(gè)潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，選擇物種為人，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，排除1個(gè)游離的無相互作用的蛋白，共包括28個(gè)節(jié)點(diǎn)、91個(gè)邊，見圖2。由圖2可知，綜合數(shù)值評(píng)分>0.9的相互作用蛋白有26個(gè)，其中前5個(gè)蛋白分別為核受體共激活劑2 (NCOA2)、類視黃醇X受體(RXRA)、雌激素受體1(ESR1)、多巴胺D2受體(DRD2)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，靶點(diǎn)基因?qū)τ诎姿幾又委煼伟┚哂兄匾饬x，具有一定的參考價(jià)值。

圖2 白藥子-抗肺癌相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network of Baiyaozi anti-lung cancer related genes

2.5分子對(duì)接結(jié)果 通過PubChem數(shù)據(jù)庫查找活性成分的三維結(jié)構(gòu)，下載化合物 MOL 結(jié)構(gòu)式，分別導(dǎo)入CB-Dock數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子對(duì)接。通常認(rèn)為，Vina評(píng)分值表明蛋白質(zhì)與化合物之間具有一定的結(jié)合活性。首先，Vina評(píng)分越小，化合物與靶標(biāo)的結(jié)合越穩(wěn)定。其次，如果空腔的大小接近或大于配體，對(duì)接的準(zhǔn)確性就會(huì)提高[13]。人表皮生長因子受體(EGFR)為肺癌最常見的致病突變，吉非替尼是目前臨床治療EGFR致病突變非小細(xì)胞肺腺癌(NSCLC)患者的一線藥物[14]。分子對(duì)接結(jié)果表明，白藥子的主要化合物對(duì)NCOA2蛋白具有良好的結(jié)合活性，見表2和圖3。

圖3 白藥子的對(duì)接模式圖A.吉非替尼；B.千金藤素；C.(S)-(6-甲氧基-4-喹啉)-[(2S，4S，5S)-5-乙烯基奎寧環(huán)-2-基]甲醇；D.可待因；E.小檗堿；F.罌粟堿；G.克班寧；H.異紫堇定堿。Fig.3 Schematic diagram of BaiyaoziA.gefitinib；B.cepharanthine；C.(S)-(6-methoxy-4-quinolyl)-[(2S，4S，5S)-5-vinylquinuclidin-2-yl]methanol；D.codeine；E.berberine；F.papaverine；G.crebanine；H.luteanin.

表2 白藥子相關(guān)化學(xué)成分與NCOA2蛋白的 Vina 得分Tab.2 Vina scores of chemical components related to Baiyaozi and NCOA2 protein

2.6關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO及KEGG通路分析 GO分析見表3。由表3可知，白藥子的88個(gè)潛在靶點(diǎn)基因的GO富集排名靠前的生物學(xué)功能主要為銨離子結(jié)合9個(gè)靶點(diǎn)：血清素3 (HRM3)、5-羥色胺受體3A (HTR3A)、乙酰膽堿酯酶 (ACHE)、溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員4 (SLC6A4)、多巴胺受體D4 (DRD4)、多巴胺受體D3 (DRD3)、溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員3 (SLC6A3)、DRD2和多巴胺受體D5 (DRD5)；神經(jīng)遞質(zhì)受體活性9個(gè)靶點(diǎn)：膽堿能受體毒蕈堿3(CHRM3)、HTR3A、阿片受體M1(OPRM1)、腎上腺素受體1(ADRB1)、DRD4、DRD3、DRD2、DRD5和組胺受體H1(HRH1)；兒茶酚胺結(jié)合7個(gè)靶點(diǎn)：腎上腺素受體2(ADRB2)、ADRB1、DRD4、DRD3、SLC6A3、DRD2和DRD5；G蛋白偶聯(lián)受體活性7個(gè)靶點(diǎn)：ADRB2、CHRM3、ADRB1、DRD4、DRD3、DRD2和HRH1；離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性6個(gè)靶點(diǎn)：鉀電壓門控通道亞家族H成員2(KCNH2)、鈉電壓門控通道α亞基5(SCN5A)、OPRM1、SLC6A4、溶質(zhì)載體家族6神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員2 (SLC6A2)和SLC6A3等，表明白藥子可通過參與調(diào)控多種生物學(xué)過程而發(fā)揮抗肺癌的作用。

表3 白藥子的GO分析Tab.3 GO analysis of Baiyaozi

KEGG通路分析見表4。由表4可知，白藥子的生物堿成分對(duì)抗腫瘤的信號(hào)通路主要為鈣離子信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路及癌癥通路等。鈣離子(Ca2+)作為一種常見的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在細(xì)胞分裂、生長、死亡過程中起到重要作用，在Ca2+的刺激下，通過一系列信號(hào)途徑激活相應(yīng)作用蛋白，可調(diào)節(jié)人體的肌肉舒張，參與骨的形成，調(diào)控細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等[15]。甲狀腺激素信號(hào)通路的關(guān)鍵基因，包括4個(gè)合成酶甲狀腺過氧化物酶(PERT)、2個(gè)代謝酶脫碘酶、1個(gè)甲狀腺激素受體(TR)[16]，可調(diào)節(jié)多種生理過程，包括細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育、分化、代謝和增殖。雌激素是多效類固醇，除了介導(dǎo)動(dòng)態(tài)平衡的生物學(xué)機(jī)制外，還在多種癌癥的發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮作用，在經(jīng)典和非經(jīng)典激素敏感型癌癥中可刺激細(xì)胞的發(fā)育、增殖、遷移和存活[17-18]。其中與癌癥中小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和甲狀腺癌等腫瘤密切相關(guān)，相關(guān)文獻(xiàn)也證實(shí)了白藥子的生物堿成分可抑制腫瘤的生長。揭示白藥子的活性成分分布于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗癌作用，也可作為未來研究白藥子抗腫瘤機(jī)制的方向。因此，初步推測(cè)白藥子的生物堿成分可通過調(diào)控鈣離子等信號(hào)通路介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制肺癌細(xì)胞的生長。

表4 白藥子的生物堿成分抗肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG代謝通路富集分析Tab.4 Enrichment analysis of the KEGG metabolic pathway of the alkaloid composition of Baiyaozi against the key targets of lung cancer

白藥子的生物堿成分抗肺癌信號(hào)通路見圖4。由圖4可知，白藥子的生物堿成分抗肺癌(小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)通過預(yù)測(cè)涉及的信號(hào)通路為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、腫瘤蛋白p53、NF-κB信號(hào)通路等，主要富集的癌基因與抑癌基因有MYC基因(癌基因)、維甲酸(RA)、FHIT基因、p53、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)基因以及磷酸酶和肌腱蛋白同源(PTEN)基因等。這些靶點(diǎn)和信號(hào)通路與癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及凋亡癌細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)。研究表明，千金藤素以劑量依賴的方式抑制H1299和A549細(xì)胞的生長，與活性氧(ROS)的產(chǎn)生和線粒體膜電位的消耗有關(guān)，此外還可通過BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)的上調(diào)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)的下調(diào)以及半胱天冬酶3(caspase-3)和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)激活來觸發(fā)非小肺癌細(xì)胞的凋亡[19]。通過白藥子的活性成分、靶點(diǎn)和疾病的關(guān)系，可為后期的實(shí)驗(yàn)研究提供新思路。

圖4 白藥子的生物堿成分抗肺癌的信號(hào)通路途徑Fig.4 The signal pathway of Baiyaozi′s alkaloids against lung cancer

3 討論

中醫(yī)藥治療腫瘤有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在中醫(yī)理論中，與致瘤因子相似的熱毒是引起腫瘤的主要原因之一?，F(xiàn)代研究表明，清熱解毒藥治療腫瘤是中醫(yī)方劑的重要組成部分[20]。千金藤具有清熱、排毒、抗菌消炎及提高免疫等功效[21]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)這些應(yīng)用與抗腫瘤密切相關(guān)。隨著分子生物學(xué)和基因組技術(shù)的發(fā)展，中藥或單一的化學(xué)成分可借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及多個(gè)復(fù)雜程序，使藥物從分子和細(xì)胞水平轉(zhuǎn)化到組織和機(jī)體水平。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方面仍然存在局限性，如千金藤素已被證實(shí)具有抗肺癌的作用，但在篩選過程中部分主成分的數(shù)據(jù)被剔除，導(dǎo)致分析的成分不夠全面，化合物間相互作用及藥動(dòng)學(xué)藥效學(xué)的研究不夠深入，還需進(jìn)行多個(gè)藥理和臨床研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，白藥子治療肺癌主要通過6種活性化合物、88種潛在靶點(diǎn)和20種信號(hào)通路，其中銨離子結(jié)合受體、神經(jīng)遞質(zhì)受體和兒茶酚胺受體等為主要候選靶點(diǎn)，對(duì)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣離子信號(hào)通路和多巴胺能神經(jīng)突觸進(jìn)行網(wǎng)狀綜合調(diào)節(jié)為白藥子抗腫瘤的主要調(diào)節(jié)機(jī)制。推測(cè)白藥子可通過神經(jīng)介質(zhì)及激素來調(diào)節(jié)生理過程，在化療并發(fā)癥期，可通過轉(zhuǎn)變機(jī)體激素及腫瘤細(xì)胞代謝，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的敏感性，從而影響癌細(xì)胞的生長、分化、代謝和增殖?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法研究白藥子的生物堿成分對(duì)肺癌的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制以及未來臨床運(yùn)用中藥治療肺癌等疾病具有重要意義。