基于主成分和聚類分析的不同地區(qū)紅花質(zhì)量評價

惠大永，張曉莉，黃壯壯，孫宇宏，馬久太，劉 峰

(1.陜西國際商貿(mào)學院，咸陽 712000；2.陜西步長制藥有限公司，咸陽 712000)

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，夏季花由黃變紅時采收，陰干或曬干[1]，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效，臨床主治冠心病、腦血栓等心腦血管疾病[2-4]。紅花的主要有效成分是黃酮類成分(包含黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及查爾酮等)[5-6]，具有廣泛的藥理活性，對心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等有一定的作用，還有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等多種生理活性[7-9]。

目前，我國紅花主產(chǎn)區(qū)主要集中在新疆、四川、云南、甘肅、河南、河北、山東、浙江和江蘇等省[10-12]，其中新疆的紅花占全國紅花產(chǎn)量的90%以上[13-14]，是臨床應(yīng)用及研究的主要來源，已成為當?shù)剞r(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)。陜西屬于干旱地區(qū)[15]，適宜種植抗旱耐寒的紅花，但因種植分散、規(guī)模小，對其研究相對較少。

本文以新疆紅花作為參考，采用UPLC法同時測定新疆和陜西紅花中3種黃酮類成分的含量，并采用主成分分析及聚類分析對2個產(chǎn)地紅花中的各成分含量進行比較，為紅花在陜西的發(fā)展提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity UPLC H-Class系統(tǒng)(PDA檢測器，Empower 3網(wǎng)絡(luò)版)，美國Waters公司；KQ-250V型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；AR1140型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2試藥 6-羥基山柰酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷對照品(批號MUST-17011503)，成都曼斯特生物科技有限公司；羥基紅花黃色素A對照品(批號111637-201308)，中國食品藥品檢定研究院；脫水紅花黃色素B對照品(批號110725-201213)，上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純，美國Fisher公司；水為超純水；其余試劑均為分析純。13批紅花樣品經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學中藥資源教研室王西芳教授鑒定均為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，來源信息見表1。

表1 紅花樣品來源信息Tab.1 The source information of safflower samples

2 方法與結(jié)果

2.1樣品含量測定

2.1.1供試品溶液的制備 取13批不同產(chǎn)地的紅花樣品各0.5 g，加水50 mL，超聲處理40 min，混勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[16]。

2.1.2混合對照品溶液的制備 精密稱取1.2項下各對照品適量，加體積分數(shù)為25%的甲醇制成3種成分質(zhì)量濃度分別為12.75，249.14，57.20 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3色譜條件 采用BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。以乙腈(A)-5 mL·L-1甲酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～5 min，2%A～8%A；5～15 min，8%A～20%A；15～22 min，20%A；22～27 min，2%A)。流速為0.1 mL·min-1;檢測波長為275 nm；柱溫為30 ℃。取2.1.1項下制備的供試品溶液及2.1.2項下制備的混合對照品溶液各10 μL，進樣[17-18]。色譜圖見圖1。

圖1 UPLC圖A.供試品溶液；B.混合對照品溶液；1.6-羥基山柰酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷；2.羥基紅花黃色素A；3.脫水紅花黃色素B。Fig.1 UPLC chromatogramsA.sample solution；B.mixed reference substance solution；1.6-hydroxy kaempferol-3，6，7-tri-O-glucoside；2.hydroxy safflower yellow A；3.dehydrated safflower yellow B.

2.2方法學考察

2.2.2精密度實驗 精密吸取2.1.2項下制備的混合對照品溶液10 μL，按照2.1.3項下色譜條件連續(xù)進樣 6 次，結(jié)果3種成分峰面積的RSD值分別為0.7%、0.8%、0.6%，均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.3重復(fù)性實驗 按照2.1.1項下方法制備6份供試品溶液，按照2.1.3項下色譜條件進樣測定。計算3種成分的含量，結(jié)果各成分含量的RSD值依次為0.3%、0.9%、1.5%，均小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4回收率實驗 精密稱取已知含量的紅花樣品6份，按照2.1.1項下方法制備供試品溶液。按照2.1.3項下色譜條件進樣，計算得到3個成分的平均回收率分別為100.34%、98.96%、96.47%，RSD 值依次為0.74%、0.91%、1.23%，各成分回收率均在95%～105%范圍內(nèi)[17]。

2.3數(shù)據(jù)分析 采用Orgin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。采用 SIMCA 14.1軟件進行主成分分析，采用 SPSS 19.0軟件進行聚類分析。

2.4結(jié)果與分析

2.4.1不同產(chǎn)地紅花的含量分析 結(jié)果見表2。由表2可知，S1～S10為新疆產(chǎn)地紅花樣品，S11～S13為陜西地區(qū)紅花樣品。采用Orgin 8.0 軟件對陜西和新疆地區(qū)紅花中的3種成分的含量進行t檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)紅花中3種成分的含量差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。其中陜西省白水縣及蒲城縣的紅花中6-羥基山柰酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷的含量最高，新疆昌吉奇臺縣的紅花中羥基紅花黃色素A的含量最高，新疆米東區(qū)八家戶村的紅花中脫水紅花黃色素B的含量最高。

表2 不同產(chǎn)地紅花中3個成分的含量 (n=3)Tab.2 The content of 3 components in safflower from different habitats (n=3)

2.4.2不同產(chǎn)地紅花主成分分析 在對13批不同地區(qū)紅花樣品中3種黃酮類成分初步分析的基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)計學軟件SIMCA 14.1進行主成分分析，進一步分析2個地區(qū)各成分的異同，結(jié)果顯示，新疆地區(qū)的紅花在第2象限和第3象限，陜西地區(qū)的紅花集中在第1象限和第4象限，產(chǎn)地能夠被較好地區(qū)分?？傮w來說，新疆各地區(qū)的紅花質(zhì)量較為相近，與陜西地區(qū)的紅花有一定差異，這與上述對各成分的差異性分析結(jié)果一致。由主成分分析可知，主成分得分從高到低為：S2>S12>S11>S1>S5>S10>S4>S7>S8>S9>S3>S6>S13，表明新疆米東區(qū)八家戶村和陜西省蒲城縣的紅花質(zhì)量較好[19-20]。

通過分析主成分荷載信息可知，第1主成分解釋了總體信息的69.4%，荷載量因子有羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B，第2主成分解釋了總體信息的22.9%，荷載量因子為6-羥基山柰酚-3，6，7-三-O-葡萄糖苷。說明羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B對紅花產(chǎn)地的區(qū)分有較大的影響。

2.4.3不同產(chǎn)地紅花聚類分析 根據(jù)主成分分析可知，3種成分的含量可以在一定程度上反映紅花的質(zhì)量，本文采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件中的系統(tǒng)聚類分析程序?qū)?3批紅花樣品進行聚類分析。在方法上采用歐氏距離測量，每兩樣本間用Averagelinkage法連接[21-22]。結(jié)果見圖2。

圖2 不同產(chǎn)地紅花的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of safflower from different habitats

由圖2可知，13批紅花樣品最終可聚成2大類：其中樣品S1～S10相似性較高聚為一類，該類樣品產(chǎn)地均為新疆地區(qū)；樣品S11～S13相似性較高聚為另一類，該類樣品產(chǎn)地均為陜西地區(qū)。說明陜西地區(qū)與新疆地區(qū)的紅花可以被明顯區(qū)分，由此推測陜西地區(qū)與新疆地區(qū)紅花的品質(zhì)確實存在一定差異，3種成分所建立的聚類分析可用于不同地區(qū)紅花的快速判斷。

3 討論

本文建立的主成分分析與聚類分析結(jié)果基本一致，說明二者結(jié)合能對新疆與陜西地區(qū)的紅花進行很好地區(qū)分。主成分分析中貢獻率較大的羥基紅花黃色素A和脫水紅花黃色素B也是文獻報道的具有良好的擴張冠狀動脈、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制和腦保護等活性的紅花藥效成分[23-25]。紅花中3種黃酮類成分均可反映不同產(chǎn)地紅花的內(nèi)在質(zhì)量，為不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量評價提供了參考。

紅花是一種優(yōu)良的經(jīng)濟作物，在藥用、食用和染色等方面具有很高的經(jīng)濟價值。我國紅花產(chǎn)區(qū)主要集中在新疆，其次為四川、云南、河南、河北、山東、浙江和江蘇等省[26]，近年來紅花的開發(fā)利用逐漸增多，種植紅花對部分地區(qū)農(nóng)民的脫貧和地方財政增收具有較大作用，還可促進鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)及地方加工業(yè)的發(fā)展，成為特色的支柱產(chǎn)業(yè)。陜西鄰近紅花主產(chǎn)區(qū)，屬于干旱地區(qū)，適宜抗寒、耐旱和耐鹽堿的紅花生長。雖然陜西紅花與新疆紅花的品質(zhì)存在一定差異，但仍可在部分貧困地區(qū)推廣種植，推動陜西的經(jīng)濟發(fā)展。