P21蛋白表達(dá)與正常宮頸組織癌變關(guān)系的meta分析

沐超，熊敏涵，袁煒，李麗紅，王婷，胡新榮

宮頸癌是起源于子宮頸上皮的惡性腫瘤。據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率排在女性惡性腫瘤的第四位，在發(fā)展指數(shù)較低的地區(qū)，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率僅次于第一位的乳腺癌。人類乳頭瘤病毒（HPV）的感染是宮頸癌的高危因素，其他危險(xiǎn)因素還包括 HIV 感染、吸煙、懷孕次數(shù)和使用口服避孕藥等[1]。P21waf1 蛋白（P21 蛋白）是抑癌基因 p21WAF1/CIP1的表達(dá)產(chǎn)物，屬于細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子。當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，P21 蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物相結(jié)合，致使其喪失活性，從而使細(xì)胞周期停滯在 G1 期，讓受損的細(xì)胞有充分的時(shí)間修復(fù)，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、衰老以及損傷修復(fù)等多種功能的調(diào)節(jié)[2-3]。已有研究顯示P21 蛋白的異常表達(dá)可能與宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。

目前，有多項(xiàng)研究報(bào)道了 P21 蛋白在宮頸癌及 CIN 中的表達(dá)情況，但尚未見(jiàn)其在宮頸癌變中差異表達(dá)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。我們通過(guò)檢索和篩選相關(guān)文獻(xiàn)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了正常宮頸組織、CIN 和宮頸癌中P21 蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率，進(jìn)而闡明 P21 蛋白表達(dá)與宮頸癌變的關(guān)系，為檢測(cè)細(xì)胞周期紊亂、評(píng)估宮頸癌的惡性行為和預(yù)后提供分子標(biāo)記及循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

檢索數(shù)據(jù)庫(kù) Pubmed、Web of Science、Medline、CBMdisc、CNKI、維普中文期刊、萬(wàn)方數(shù)據(jù)，檢索時(shí)間自建庫(kù)至 2020年5月，中文檢索關(guān)鍵詞包括：P21waf1、宮頸癌、宮頸腫瘤。英文檢索關(guān)鍵詞包括：P21waf1、Cervical Neoplasms、Cervical Carcinoma。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 P21 蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 研究類型 P21 蛋白在宮頸病變組織中表達(dá)差異的病例-對(duì)照研究，對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)已見(jiàn)刊并具有相應(yīng)資料。文種限中文和英文。

1.2.3 研究對(duì)象：①所有病例經(jīng)病理診斷明確；②全部受試者取材前都未經(jīng)放化療；③研究方法相似；④全部受試者不界定民族、種族、國(guó)籍等。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)文獻(xiàn)；②無(wú)相應(yīng)對(duì)照組，數(shù)據(jù)提供不全；③非免疫組織化學(xué)法、非正常宮頸組織作為對(duì)照；④綜述、動(dòng)物研究、會(huì)議摘要及病例系列報(bào)道等。

1.2.5 文獻(xiàn)篩選與資料提取 文獻(xiàn)篩選和資料提取分別由兩位研究人員獨(dú)立進(jìn)行，涉及不一致的地方，通過(guò)協(xié)商或第三方裁定。提取信息包括：題目、作者姓名、發(fā)表年限、納入病例的年齡范圍、病例總數(shù)、宮頸病變中 P21 蛋白表達(dá)陽(yáng)性數(shù)等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用 Revman5.3 軟件對(duì)所有納入的研究進(jìn)行分析。通過(guò)查找相關(guān)資料，選擇比值比（odds ratio，OR）作為合并效應(yīng)量，95% 為其可信區(qū)間（95%CI）。首先，對(duì)納入的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)為 α = 0.05），采用森林圖和I2統(tǒng)計(jì)量來(lái)判斷研究間的異質(zhì)性。根據(jù)《Cochrane 系統(tǒng)評(píng)價(jià)手冊(cè)》，I2＞ 50% 則認(rèn)為研究間存在異質(zhì)性。對(duì)于存在異質(zhì)性的結(jié)果，利用漏斗圖進(jìn)行發(fā)表偏倚的判斷。最后，進(jìn)行敏感性分析，如果敏感性分析前后結(jié)果沒(méi)有本質(zhì)上改變，則說(shuō)明結(jié)果穩(wěn)定且較為可信；如果敏感性分析得到的結(jié)果不同，則在排除異常的研究后重新分析，并探討該研究影響合并效應(yīng)的原因。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，初步得到 497 篇文獻(xiàn)，其中 Pubmed 227 篇、Web of Science 97 篇、Medline 56 篇、CBMdisc 32 篇、CNKI 26 篇、維普 24 篇、萬(wàn)方 35 篇，按照標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選后，總共納入文獻(xiàn)14 篇[5-18]，共 1588 例受試者，包括正常宮頸組織269 例、CIN 390 例，宮頸癌 929 例。文獻(xiàn)篩選流程見(jiàn)圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程Figure 1 Literature screening process

2.2 納入研究的基本特征和方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)

14 份研究報(bào)道了正常宮頸組織和宮頸癌中P21 蛋白表達(dá)的情況；8 份研究[6,8-10,12-13,17-18]報(bào)道了 CIN 中 P21 蛋白表達(dá)的情況。納入研究的基本特征和方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)分別見(jiàn)表1 和表2。

表1 納入研究的基本特征Table 1 Basic features of the included studies

表2 納入研究的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)（紐卡斯?fàn)?渥太華量表）Table 2 Methodological quality evaluation of included studies (Newcastle-Ottawa Scale)

2.3 Meta 分析結(jié)果

2.3.1 宮頸癌組與正常宮頸組共 14 個(gè)研究報(bào)道了宮頸癌組（929 例）與正常宮頸組（269 例）中 P21 蛋白的表達(dá)情況。森林圖顯示：I2= 86%，P＜ 0.00001，各項(xiàng)研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型；OR = 9.51，95%CI（2.82，32.11），P= 0.0003，可知宮頸癌組與正常宮頸組 P21 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 宮頸癌組與正常宮頸組 P21 蛋白表達(dá)的比較Figure 2 Comparison of P21 protein expression between cervical cancer group and normal cervical group

2.3.2 宮頸癌組與 CIN 組共 8 個(gè)研究報(bào)道了宮頸癌組（404 例）與 CIN 組（390 例）中 P21 蛋白的表達(dá)情況。森林圖顯示：I2= 79%，P＜ 0.0001，各項(xiàng)研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型；OR =1.18，95%CI（0.54，2.55），P= 0.68，可知宮頸癌組與 CIN 組 P21 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 宮頸癌組與 CIN 組 P21 蛋白表達(dá)的比較Figure 3 Comparison of P21 protein expression between cervical cancer group and CIN group

2.3.3 CIN 組與正常宮頸組 共 8 個(gè)研究報(bào)道了 CIN 組（390 例）與正常宮頸組（150 例）中 P21蛋白的表達(dá)情況。森林圖顯示：I2= 72%，P=0.0008，各項(xiàng)研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型；OR = 3.25，95%CI（0.97，10.87），P= 0.06，可知 CIN 組與正常宮頸組 P21 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 CIN 組與正常宮頸組 P21 蛋白表達(dá)的比較Figure 4 Comparison of P21 protein expression between CIN group and normal cervical group

2.3.4 發(fā)表偏倚的識(shí)別 分別對(duì)宮頸癌組與正常宮頸組、宮頸癌組與 CIN 組、CIN 組與正常宮頸組進(jìn)行漏斗圖繪制，結(jié)果見(jiàn)圖5A、B、C。由圖知，三個(gè)比較組的漏斗圖對(duì)稱性欠佳，提示可能存在發(fā)表偏倚。

圖5 漏斗圖（A：宮頸癌組與正常宮頸組；B：宮頸癌組與 CIN 組；C：CIN 組與正常宮頸組）Figure 5 Funnel plot (A:Cervical cancer group versus normal cervical group; B:Cervical cancer group versus CIN group; C:CIN group versus normal cervical group)

2.3.5 敏感性分析 以 OR 為效應(yīng)尺度指標(biāo)，用“去除單項(xiàng)研究法”考察單項(xiàng)研究對(duì)總合并效應(yīng)量的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)去除文獻(xiàn)[6]和[10]兩項(xiàng)研究后，重新進(jìn)行分析，結(jié)果分別為：①宮頸癌組與正常宮頸組I2= 0%，P= 0.64，達(dá)到同質(zhì)，符合固定效應(yīng)模型條件，可知 P21 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，宮頸癌組大于正常宮頸組[OR = 17.75，95%CI（10.87，28.99）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.00001）（圖6A）。②宮頸癌組與 CIN 組I2= 59%，P= 0.03，仍存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，可知 P21 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，宮頸癌組與 CIN 組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR = 1.88，95%CI（0.97，3.62），P= 0.06]（圖6B）。③CIN 組和正常宮頸組I2= 43%，P= 0.12，異質(zhì)性降低，符合固定效應(yīng)模型條件，可知 P21 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率，CIN 組大于正常宮頸組[OR = 6.10，95%CI（3.03，12.32）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.00001）（圖6C）。其余各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)行敏感性分析，結(jié)果均一致。

3 討論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的健康。目前宮頸癌的治療包括手術(shù)切除、放化療以及靶向治療[19]，為了提高宮頸癌患者無(wú)進(jìn)展生存率，提高患者的生活質(zhì)量，降低治療毒副作用，在探討宮頸癌最佳治療方案的同時(shí)也需要探究能夠評(píng)估宮頸癌惡性行為和預(yù)后的相關(guān)分子。p21WAF1/CIP1基因表達(dá)的 P21waf1 蛋白，定位于細(xì)胞核，是 P53 途徑重要的下游蛋白[20]。作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，生理情況下，P21 蛋白參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、衰老以及受損后修復(fù)等過(guò)程。雖然P21 蛋白承擔(dān)著抑癌的角色，但是在許多研究中發(fā)現(xiàn)，它在腫瘤中的表達(dá)是上調(diào)的，其通過(guò)作用于G1/S 檢測(cè)點(diǎn)，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。P21 蛋白升高的原因可能是 P21 蛋白的表達(dá)被 p53 非依賴的通路誘導(dǎo)[21-22]，或者腫瘤已變成 p21WAF1/CIP1介導(dǎo)的抑制信號(hào)細(xì)胞，逃避了衰老（終末分化）和生長(zhǎng)停滯[3]。因此，它可以作為檢測(cè)細(xì)胞周期紊亂、估計(jì)腫瘤惡性行為和預(yù)后的分子標(biāo)記。

本次系統(tǒng)評(píng)價(jià)顯示：當(dāng)剔除文獻(xiàn)[6]和[10]兩項(xiàng)研究結(jié)果后，三個(gè)組的異質(zhì)性都出現(xiàn)了下降，通過(guò)對(duì)比前后森林圖和漏斗圖，可知這兩項(xiàng)研究出現(xiàn)了發(fā)表偏倚，對(duì)合并效應(yīng)產(chǎn)生了較大的影響，同時(shí)也是異質(zhì)性的來(lái)源，其原因可能與他們所報(bào)道的正常宮頸組織中 P21 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高有關(guān)。在重新進(jìn)行分析后，最后結(jié)果顯示：與正常宮頸組織相比，P21 蛋白在宮頸癌組以及 CIN 組中均表達(dá)上調(diào)，與多數(shù)學(xué)者報(bào)道的研究[5,7-9,11-18]結(jié)果一致，提示 P21 蛋白異常高表達(dá)增加了正常宮頸上皮癌變的風(fēng)險(xiǎn)；然而在以往的研究中，也有學(xué)者報(bào)道 P21蛋白在宮頸癌中表達(dá)是降低的。例如，苗立業(yè)等[23]認(rèn)為 P21 蛋白在 CIN 和宮頸癌中表達(dá)陽(yáng)性率逐漸減低，表達(dá)強(qiáng)度與病變級(jí)別呈負(fù)相關(guān)，究其原因可能與組蛋白去乙?；?1（HDAC1）的作用有關(guān)。另外，在動(dòng)物試驗(yàn)中，Shin 等[24]發(fā)現(xiàn)與 p21(+/+)小鼠相比，p21(-/-) 小鼠宮頸病變更明顯，原因可能與外源性雌激素的使用有關(guān)。本次分析結(jié)果在較大數(shù)據(jù)層面上支持了 P21 蛋白在宮頸癌組大于正常宮頸組、CIN 組大于正常宮頸組，且兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，宮頸癌組與 CIN 組比較的結(jié)果顯示 P21 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)，有待于更多的樣本量來(lái)明確宮頸癌P21 蛋白的表達(dá)水平是否高于 CIN。綜上所述，P21waf1 蛋白表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)正常宮頸組織癌變，檢測(cè) P21waf1 蛋白的表達(dá)有助于評(píng)估宮頸癌的惡性行為和預(yù)后。

圖6 敏感性分析（A：宮頸癌組與正常宮頸組；B：宮頸癌組與 CIN 組；C：CIN 組與正常宮頸組）Figure 6 Sensitivity analysis (A:Cervical cancer group versus normal cervical group; B:Cervical cancer group versus CIN group;C:CIN group versus normal cervical group)

本次分析不排除有一定的局限性：①收集了公開(kāi)發(fā)表的中、英文文獻(xiàn)，但 CIN 組樣本量仍較少；②國(guó)內(nèi)、國(guó)外各個(gè)研究中的組織標(biāo)本處理方法、免疫組化判定主觀性等可能會(huì)對(duì)原始數(shù)據(jù)的一致性產(chǎn)生影響。