HPLC法測定米鉑白蛋白結(jié)合型納米制劑中米鉑的含量

王丹，馮文凱，林東方，郭曉茹，王雪蕾，苗慶芳，夏桂民

米鉑屬于第三代鉑類抗腫瘤藥物，療效確切[1-2]，但目前僅有米鉑混懸注射液上市，且只能通過肝動脈栓塞給藥用于肝癌的介入性治療，限制了米鉑的臨床應(yīng)用[3]。為促進(jìn)米鉑納米制劑的發(fā)展，在米鉑脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上[4]，本課題組又成功構(gòu)建了米鉑白蛋白結(jié)合型納米制劑（簡稱“米鉑白蛋白”，HSA-miriplatin），期望進(jìn)一步拓展米鉑的臨床適應(yīng)證。

準(zhǔn)確、快速地測定納米制劑中主藥的含量是開展后續(xù)研究的前提。高效液相色譜（HPLC）是測定納米制劑中藥物含量的常用方法，由于米鉑分子中含有重金屬元素鉑，也可以采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）進(jìn)行含量測定。但是 ICP-MS法僅能測得總鉑的含量，卻無法區(qū)分米鉑與含鉑的降解產(chǎn)物等雜質(zhì)，而且 ICP-MS 法測試成本較高，因此探索使用 HPLC 法測定納米制劑中米鉑的含量。

在進(jìn)行含量測定之前，需要開展除蛋白等大分子的樣品前處理工作，以便將米鉑從結(jié)合型納米制劑中高效提取出來。米鉑白蛋白與米鉑脂質(zhì)體的樣品前處理方法有著本質(zhì)的不同。米鉑脂質(zhì)體是將米鉑物理包裹在磷脂雙分子形成的疏水雙層膜中，有機(jī)溶劑（如甲醇等）溶解磷脂分子后，米鉑釋放到介質(zhì)中，完成破乳，順利提取米鉑，開展含量測定分析。米鉑白蛋白是利用氫鍵或疏水作用力將疏水性藥物米鉑鑲嵌在白蛋白內(nèi)部疏水腔中[5-7]。去除蛋白的常用方法是加入合適的有機(jī)溶劑使其變性，令蛋白以沉淀形式析出，再通過離心除去。所以，要在蛋白大分子析出之前釋放出米鉑，并使水中幾乎不溶的米鉑溶解在介質(zhì)中，這是實(shí)現(xiàn) HPLC 法分析檢測的先決條件。因此，需要建立一個(gè)適合于米鉑白蛋白的樣品前處理方法。

本研究建立了米鉑白蛋白的樣品前處理方法，并用 ICP-MS 法進(jìn)行了對比驗(yàn)證；建立了簡便、專屬性強(qiáng)的 HPLC 方法用于米鉑白蛋白中米鉑的定量分析，并對該方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

高效液相色譜儀（e2695 泵，SPD-M20A 檢測器，CBM-20A 系統(tǒng)控制器，LabSolutions 工作站）購自美國 Waters 公司；辛烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）購自美國安捷倫科技有限公司；EmulsiFlex-C3 高壓均質(zhì)機(jī)購自加拿大 Avestin 公司；IKA T25 分散器購自德國 IKA公司；3-18KS 高速臺式冷凍離心機(jī)購自美國 Sigma公司；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士 Buchi 公司；XSE105 分析天平購自瑞士梅特勒公司；Nano-ZS納米粒度電位儀購自英國 Malvern 公司。

米鉑白蛋白和空白白蛋白（HSA）為實(shí)驗(yàn)室自制；米鉑原料藥（純度 99.6%，批號 M20171214）購自昆明貴研藥業(yè)有限公司；5% 葡萄糖注射液（批號 A2018092）購自華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）購自美國 Fisher Scientific 有限公司；高純氮（純度 ≥ 99.99%）購自北京東方醫(yī)用氣體有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 米鉑白蛋白的前處理方法 取米鉑白蛋白0.1 ml，分別加入 2、3、4、5、6、7、8、9、10 ml甲醇沉淀蛋白并提取米鉑，充分混勻后取 2 ml 在4 ℃ 條件下 12000×g離心 10 min，取上清重復(fù)離心一次，取上清進(jìn)行 HPLC 分析。

用 ICP-MS（iCAPQ）測定樣品中的鉑含量。取米鉑白蛋白 0.1 ml，加入 5 ml 硝酸和 1 ml 高氯酸，于 180 ℃ 電熱板上消解，至無明顯反應(yīng)現(xiàn)象，溶液透明幾乎無沉淀且總體積小于 1 ml，冷卻至室溫后，用超純水定容至 10 ml。取消解溶液上機(jī)測試。

1.2.2 工作溶液的配制 供試品溶液：取米鉑白蛋白 0.1 ml，加入 6 ml 甲醇，充分混勻后取 2 ml在 4 ℃ 條件下 12000×g離心 10 min，取上清重復(fù)離心一次，上清即為供試品溶液。空白對照溶液：精密量取 0.1 ml HSA，按照米鉑白蛋白同法操作。米鉑對照溶液：精密稱取米鉑 3.00 mg，置于 100 ml容量瓶中，加少許甲醇，超聲使其溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為 30.00 μg/ml 的米鉑對照溶液。

1.2.3 色譜條件 采用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-水（91:1:8）；流速為 1.0 ml/min；檢測波長為 210 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μl。

1.2.4 系統(tǒng)適用性 取供試品溶液、空白對照溶液和米鉑對照溶液，在 190～400 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，記錄掃描圖譜。取供試品溶液、空白對照溶液和米鉑對照溶液，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖。

1.2.5 專屬性驗(yàn)證 采用強(qiáng)堿和高溫等極端條件破壞受試樣品，考察米鉑色譜峰能否與其他降解產(chǎn)物等雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)基線分離，進(jìn)一步驗(yàn)證所建立方法是否具有良好的專屬性。分別取米鉑白蛋白、空白、米鉑對照溶液各 2 份，進(jìn)行以下破壞性試驗(yàn)，再進(jìn)行 HPLC 分析。

強(qiáng)堿破壞：精密量取米鉑白蛋白、空白和米鉑對照溶液 4 ml，向其中加入 1 mol/L 氫氧化鈉溶液 1 ml，室溫避光放置 3 h 進(jìn)行堿破壞，照“1.2.2”項(xiàng)下操作得堿破壞供試品溶液、空白和米鉑對照液。

高溫破壞：精密量取米鉑白蛋白、空白和米鉑對照溶液 4 ml，在 65 ℃ 水浴中避光加熱 6 h，照“1.2.2”項(xiàng)下操作得高溫破壞供試品溶液、空白和米鉑對照溶液。

1.2.6 線性與范圍 精密量取米鉑適量，甲醇溶解，并遞倍稀釋，得濃度分別為 3.63、7.27、14.53、29.07、58.13、87.20、130.80 μg/ml 的 7 種不同濃度的米鉑溶液，照“1.2.3”項(xiàng)下操作，記錄峰面積。以米鉑峰面積 A 對米鉑濃度 C（μg/ml）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.2.7 檢測限與定量限 精密量取米鉑白蛋白適量，用 5% 葡萄糖溶液稀釋，照“1.2.2”項(xiàng)下處理樣品，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行 HPLC 分析，記錄峰面積，以信噪比為 3:1 和 10:1 時(shí)對應(yīng)的米鉑的量為檢測限和定量限。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的米鉑白蛋白6 份，照“1.2.2”項(xiàng)下處理樣品，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行 HPLC 分析，記錄米鉑峰面積，計(jì)算米鉑白蛋白中米鉑濃度。

1.2.9 精密度試驗(yàn) 取同一批次的米鉑白蛋白，照“1.2.2”項(xiàng)下處理樣品，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行HPLC 分析，同 1 天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄色譜峰，計(jì)算米鉑白蛋白中米鉑的濃度，統(tǒng)計(jì)米鉑濃度的日內(nèi)精密度。另取同一批次米鉑白蛋白，連續(xù)6 d，每天同法操作，統(tǒng)計(jì)米鉑濃度的日間精密度。

1.2.10 回收率試驗(yàn) 精密稱取米鉑 2.40、3.00、3.60 mg 各 3 份，分別置于 100 ml 量瓶中，加少許甲醇并超聲使米鉑完全溶解，分別加入空白對照1.5 ml，用甲醇定容至刻度，搖勻，照“1.2.2”項(xiàng)下處理樣品，得低、中、高三個(gè)濃度的供試品溶液。照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行 HPLC 分析，通過峰面積計(jì)算得到的米鉑濃度為實(shí)測值，用稱量值計(jì)算得到的米鉑濃度為理論值，實(shí)測值與理論值之比為回收率。

1.2.11 耐用性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在不同流速（0.99、1.00、1.01 ml/min）和不同柱溫（28、30、32 ℃）條件下，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行HPLC 分析，記錄峰面積。

1.2.12 含量測定 取三批米鉑白蛋白，照“1.2.2”項(xiàng)下處理樣品，照“1.2.3”項(xiàng)下進(jìn)行HPLC 分析，計(jì)算米鉑含量。

2 結(jié)果

2.1 米鉑白蛋白的前處理方法的驗(yàn)證

2.1.1 蛋白沉淀劑的選擇與確立 甲醇和乙腈是常用的蛋白沉淀劑，但是米鉑在乙腈中的溶解度很低（≤ 2.6 μg/ml），在甲醇中的溶解度稍高（0.614 mg/ml），為保證米鉑白蛋白中的米鉑充分溶解在介質(zhì)中，首選甲醇作為米鉑白蛋白的蛋白沉淀劑。研究中發(fā)現(xiàn)，甲醇與米鉑白蛋白的體積比會顯著影響 HPLC 方法的測定結(jié)果，因此考察了甲醇與米鉑白蛋白的體積比對米鉑含量檢測的影響。

結(jié)果如圖1 所示，當(dāng)甲醇與米鉑白蛋白體積比小于 30:1 時(shí)，米鉑含量測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大；當(dāng)甲醇與米鉑白蛋白體積比在 30:1 至 100:1之間時(shí)，測得值趨于穩(wěn)定，且當(dāng)甲醇與米鉑白蛋白體積比為 60:1 時(shí)，米鉑含量測得值的標(biāo)準(zhǔn)偏差最小。因此確定甲醇與米鉑白蛋白體積比 60:1 作為樣品前處理方法，即：精密量取 0.1 ml 米鉑白蛋白，加入 6 ml 甲醇，充分振蕩、搖勻，在 4 ℃ 條件下 12000×g離心 10 min，取上清液，同法再離心一次，上清液即為供試品溶液。

圖1 提取溶劑（甲醇）的用量對米鉑白蛋白中米鉑檢測的影響（n = 3）Figure 1 The effect of ratio of methanol to HSA-miriplatin on the determination of miriplatin (n = 3)

2.1.2 米鉑白蛋白前處理方法的驗(yàn)證 ICP-MS是測定重金屬元素（如鉑）的常用方法[8]，對于含有大量蛋白的生物樣品同樣具有很高的靈敏度[9-10]，因此 ICP-MS 法可以用來檢測米鉑白蛋白中的鉑。ICP-MS 法通過強(qiáng)酸消解樣品中的有機(jī)物，使鉑元素完全溶解，測定樣品中鉑的總量。ICP-MS 法不受樣品前處理方法的影響，不用分離提取，可以準(zhǔn)確測定樣品中鉑的總量，因此比較 ICP-MS 法和HPLC 法對同一份米鉑白蛋白樣品的測定值，可以判斷甲醇對米鉑白蛋白中米鉑的提取是否充分，進(jìn)而判斷該制劑的前處理方法是否準(zhǔn)確可行。

取 3 個(gè)批次的制劑，分別用 HPLC 法和ICP-MS 法測定，其中鉑含量見表1，結(jié)果表明，HPLC 法鉑含量的測得值與 ICP-MS 法鉑含量的測得值之間的差異沒有顯著性（P= 0.06），且HPLC 法鉑含量的測得值不低于 ICP-MS 法鉑含量的測得值，表明本文建立的該制劑前處理方法對制劑中鉑的提取充分、可行。

表1 比較 HPLC 法和 ICP-MS 法測定米鉑白蛋白中鉑含量Table 1 The determination of platinum in HSA-miriplatin by HPLC and ICP-MS

2.2 系統(tǒng)適用性

紫外掃描結(jié)果顯示，供試品溶液和米鉑對照溶液均在 210 nm 處有最大吸收，空白對照溶液在210 nm 處無吸收，故選擇 210 nm 為檢測波長。HPLC 分析圖譜顯示（圖2），在供試品溶液和米鉑對照溶液中，米鉑色譜峰的保留時(shí)間均約為16.1 min，空白對照溶液在此處無干擾，表明本方法系統(tǒng)適用性良好。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜圖（a：米鉑；b：空白對照；c：米鉑白蛋白；1：米鉑）Figure 2 Chromatograms of system suitability (a:Miriplatin;b:Blank HSA; c:HSA-miriplatin; 1:Miriplatin)

2.3 專屬性驗(yàn)證

對強(qiáng)堿和高溫破壞的供試品溶液、空白對照溶液和米鉑對照溶液進(jìn)行 HPLC 分析，結(jié)果如圖3所示，米鉑色譜峰與強(qiáng)堿、高溫破壞產(chǎn)生的降解產(chǎn)物色譜峰均能有效分離，說明本方法專屬性良好。

圖3 專屬性驗(yàn)證[A：強(qiáng)堿破壞（a：米鉑白蛋白；b：空白；c：米鉑對照溶液）；B：高溫破壞（a：米鉑白蛋白；b：空白；c：米鉑對照溶液）；1：米鉑]Figure 3 Verification of specificity [A:Chromatograms of HSA-miriplatin (a),blank HSA (b) and free miriplatin (c) suffered the destruction by strong base; B:Chromatograms of HSA-miriplatin (a),blank HSA (b) and free miriplatin (c) suffered the destruction by high temperature; 1:Miriplatin]

2.4 線性與范圍

對不同濃度的米鉑工作液進(jìn)行 HPLC 分析，以米鉑峰面積 A 為縱坐標(biāo)，米鉑濃度 C（μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A = 9×106C-49170，r= 0.9995。結(jié)果表明，在 3.63～130.80 μg/ml范圍內(nèi)米鉑濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 檢測限與定量限

經(jīng)檢測，米鉑的檢測限為 2.67 ng（S/N =3），定量限為 9.80 ng（S/N= 10）。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

對來自同一批次米鉑白蛋白的 6 份樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，米鉑濃度的 RSD 為 1.62%（n = 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

米鉑濃度的日內(nèi)精密度 RSD 為1.62%（n = 6），米鉑濃度的日間精密度 RSD 為 1.32%（n = 6），表明該方法精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)得低、中、高 3 個(gè)濃度的平均回收率分別為（99.46 ± 0.24）%、（99.20 ± 1.38）%、（98.30 ±0.26）%，三個(gè)濃度回收率的 RSD 值分別為0.24%、1.39%、0.27%（表2）。

表2 回收率實(shí)驗(yàn) （n =3）Table 2 Summary of recovery results (n = 3)

2.9 耐用性試驗(yàn)

液相流速在 0.99～1.01 ml/min 范圍內(nèi)變化時(shí)，米鉑峰面積的 RSD 為 1.01%（表3），液相柱溫在 28～32 ℃ 范圍內(nèi)變化時(shí)，米鉑峰面積的RSD 為1.14%（表4），表明此方法耐用性良好。

表3 流速變化的耐用性試驗(yàn)結(jié)果（n = 9）Table 3 Robustness results under slightly changes of flow rate (n = 9)

表4 柱溫變化的耐用性試驗(yàn)結(jié)果（n = 9）Table 4 Robustness results under slightly changes of column temperature (n = 9)

2.10 含量測定

3 批次米鉑白蛋白中米鉑的含量測定結(jié)果見表5。

表5 3 批次米鉑白蛋白含量測定結(jié)果（n = 3）Table 5 Content determination for three batches of HSA-miriplatin (n = 3)

3 討論

在方法學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白沉淀劑與米鉑白蛋白體積比會顯著影響主藥的含量測定結(jié)果，提示建立 HPLC 方法時(shí)，在考慮色譜條件的同時(shí)，還應(yīng)探究最佳的樣品稀釋倍數(shù)，同時(shí)，在流動相中加入少量乙腈可以改善峰形，提高準(zhǔn)確度。

在方法學(xué)驗(yàn)證的破壞性實(shí)驗(yàn)中，游離的米鉑原料藥在強(qiáng)堿（0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液，室溫避光放置 3 h）和高溫條件（65 ℃ 水浴中避光加熱 6 h）下，幾乎完全被破壞，而將米鉑嵌入白蛋白中構(gòu)建成納米制劑后，同條件下米鉑的穩(wěn)定性顯著提高，顯示出該制劑可顯著提高包載藥物的穩(wěn)定性。

本研究建立了米鉑白蛋白中米鉑含量測定的HPLC 方法，通過系統(tǒng)的方法學(xué)研究與驗(yàn)證，認(rèn)為本方法操作簡便、專屬性好、準(zhǔn)確度高，適于該制劑中米鉑含量的測定。本法對其他白蛋白結(jié)合型納米制劑的含量測定具有指導(dǎo)和參考意義。