傘形花內酯處理對采后徐香獼猴桃果實灰霉病抗的影響

徐文雅 朱玉燕 徐啟航 李生娥 沈淑鈴 姚蘭英 鄭小林

(1浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2德清秋水果汁有限公司，浙江 德清 313216)

獼猴桃(Actinidiaspp)采后的主要病害有軟腐病、蒂腐病、青霉病、炭疽病和灰霉病等[1]。其中，灰霉病可在獼猴桃的花期、幼果期和貯藏期等各個時期發(fā)生，對我國獼猴桃產業(yè)造成較大的經濟損失[2]。研究表明，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的獼猴桃采后腐爛率高達30%以上[3-4]?；颐咕粌H具有較強的潛伏侵染能力，而且其生長溫度范圍較寬，在低溫條件下也能正常生長發(fā)育，如在0℃條件下可依舊保持致病力[5]。目前，生產實踐中常采用化學殺菌劑來防治灰霉病，但化學殺菌劑殘留影響果品的食用安全性。因此，開發(fā)安全、有效、無毒的天然殺菌誘抗劑已成為獼猴桃采后研究的熱點之一。

傘形花內酯，又名傘形酮、7-羥基香豆素，是蕓香科和傘形科香豆素類中最簡單的一種多酚物質，主要存在于瑞香狼毒、雪蓮等中草藥中，具有抗菌、抗氧化、抗癌等多種藥理作用，但其含量在天然植物中較低，提取比較困難，目前獲得傘形花內酯的途徑多為化學合成[6]。傘形花內酯抗細菌和抗真菌活性中等，其中對真菌的最小抑制濃度(minimal inhibit concentration，MIC)為500～1 000 μg·mL-1，其對小鼠的半致死量(median lethal dose，LD50)為450 mg·kg-1[7]。研究表明傘形花內酯對桃褐腐病菌、棉花紅腐病菌、草莓灰霉病菌、辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其中對草莓灰霉菌的MIC 為2 000 μg·mL-1[8]，說明傘形花內酯具有廣譜抑菌性。浙江工商大學鄭小林課題組前期研究發(fā)現傘形花內酯能夠誘導提高獼猴桃采后果實對青霉病的抗性，有助于保持獼猴桃采后果實品質[9]。為了進一步明確傘形花內酯對獼猴桃果實采后主要病害的控制效果，本試驗研究了傘形花內酯處理對采后損傷接種灰霉菌獼猴桃果實的抗病機理，以期為傘形花內酯應用于獼猴桃果實采后病害防治提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美味獼猴桃徐香果實于2018年10月9日采摘自浙江省臺州市花積山獼猴桃種植基地，當天運回杭州實驗室進行處理。

灰霉菌，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室保存菌株；傘形花內酯(純度為99%)，杭州阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800 型紫外分光光度計，日本島津公司；TGL-16M 型高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；HH-S型數顯恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；SW-CJ-2D 型超凈工作臺，上海滬粵明科學儀器有限公司；MIR-553 型恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO 公司；FMH-5型滅菌鍋，日本Takemura 公司；DM4000 型高倍顯微鏡，德國徠卡顯微系統(tǒng)公司；Milli-Q 型超純水裝置，美國MILLIPORE 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備 灰霉菌孢子懸浮液的制備參考邵興鋒等[10]的方法。將灰霉菌菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)上進行多次活化，將活化好的灰霉菌接種于新PDA 平板，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，將含0.05% Tween-20 的無菌水放于長滿灰霉菌的平板，并用無菌涂布棒刮菌，刮完用三層無菌紗布過濾，收集孢子于無菌錐形瓶，調節(jié)孢子懸浮液濃度為1.5×106個·mL-1，待用。

1.3.2 試驗處理 選取表面無機械損傷、無病蟲害、無斑且大小和成熟度基本一致的徐香獼猴桃果實，用1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min 后，再分別用0、0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯溶液浸泡10 min，其中以0 mg·mL-1組為對照(CK)。浸泡完畢自然晾干后放入22℃環(huán)境中貯藏48 h，之后用含75% 酒精棉球對獼猴桃赤道部位消毒，用滅菌的鐵釘在獼猴桃赤道部位等間距刺3 個3 mm×3 mm 大小的傷口，1 h 后于每個傷口接種20 μL 1.3.1 中制備的灰霉菌孢子懸浮液，分批按每框35 個放入框中，框里放入濕潤的紙巾以保持高濕度(相對濕度為85%～90%)，在框外套厚度為0.05 mm 的聚乙烯薄膜袋，袋上扎數個小孔，袋口不封口且自然合攏，置于22℃條件下貯藏。接菌當天按0 d 算，之后每2 d 取一次樣，每次取40 個果，取病斑周圍1 cm 處果肉作為試驗樣品，果肉切碎混勻，將CK和處理果實果肉分成三組，用液氮進行速凍并保存在-80℃冰箱，用于后續(xù)相關指標的測定。每個指標重復測定3 次。

1.3.3 灰霉菌孢子萌發(fā)率和體外菌落直徑的測定孢子萌發(fā)率:灰霉菌孢子萌發(fā)率的測定參考鄭劍等[9]的方法。用直徑7 mm 無菌打孔器選取無菌的PDA餅，將PDA 餅放置在滅過菌的玻片上，然后將玻片置于中央有潤濕濾紙片的培養(yǎng)皿中。在PDA 餅上分別加入30 μL 清水(含無水乙醇)、0.5 mg·mL-1和1.0 mg·mL-1傘形花內酯溶液，待干后，加入20 μL 1.3.1制備的灰霉菌孢子懸浮液，培養(yǎng)8 h 后，在顯微鏡下觀察灰霉菌孢子的萌發(fā)情況并測定其萌發(fā)率(孢子芽管長度等于或大于孢子直徑的一半即視為萌發(fā))，每組重復3 次。

體外菌落直徑的測定:灰霉菌體外菌落直徑的測定參考鄭劍等[9]的方法。經滅菌后的PDA 冷卻至55～60℃時，加入清水(含無水乙醇)和傘形花內酯使PDA 中傘形花內酯濃度為0、0.5 和1.0 mg·mL-1，然后倒入培養(yǎng)基中，待冷卻凝固后備用。在培養(yǎng)皿中央放入直徑為1 cm 的無菌圓形濾紙片，并在上面加入100 μL 1.3.1 制備的灰霉菌孢子懸浮液，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，并分別于第3、第5、第7 天用十字交叉法測定菌落直徑。每組重復5 次。

1.3.4 獼猴桃病斑面積的測定 獼猴桃經損傷接種灰霉菌后，于22℃條件下貯藏，分別在第0、第2、第4、第6、第8 天觀察果實發(fā)病情況并用十字交叉法測定其病斑直徑，計算病斑面積，每組每次30 個果，10 個果為1 次重復。

1.3.5 幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的測定幾丁質酶(chitinase，CHT) 活性的測定參考Boller等[11]的方法。以每秒鐘每克樣品(鮮重)中酶分解膠狀幾丁質所產生的1 μmolN-乙酰葡萄糖胺作為一個CHT 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。每個樣品重復測定3 次。

β-1，3-葡聚糖酶(β-1，3-glucanase，GLU)活性的測定參考Zong 等[12]的方法。以每秒鐘每克樣品(鮮重)中酶分解昆布多糖產生1×10-9mol 葡萄糖作為一個GLU 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酰-輔酶A 連接酶活性的測定 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)活性的測定參考Liu 等[13]的方法。以每小時每克樣品(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01 為一個PAL 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。

4-香豆酰-輔酶A 連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase，4-CL)活性的測定參考黃玉平等[14]的方法。以每分鐘每克樣品(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01為一個4-CL 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.7 過氧化物酶和多酚氧化酶活性的測定 過氧化物酶(peroxidase，POD)活性的測定參考Srivastava等[15]的方法。以每分鐘每克樣品(鮮重)的吸光度值變化0.01 為一個POD 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性的測定參考Sugumaran 等[16]的方法。以每分鐘每克樣品(鮮重)的吸光度值變化0.001 為一個PPO 活性單位(U)，用U·g-1FW 表示。

1.3.8 總酚、類黃酮和木質素的測定 總酚含量的測定參考Kaur 等[17]的方法。測定樣品液在765 nm 波長處的吸光度值，根據吸光度值在標準曲線上查得相應的沒食子酸含量(μg)，計算總酚含量。

類黃酮含量的測定參考Wang 等[18]的方法。測定樣品液在325 nm 波長處的吸光度值，根據吸光度值在標準曲線上查得相應的蘆丁含量(mg)，計算類黃酮含量。

木質素含量的測定參考Syros 等[19]的方法，略作修改。測定樣品液在280 nm 波長處的吸光度值，木質素含量用OD280·g-1FW 表示。

1.4 數據分析與統(tǒng)計

采用 Microsoft Office Excel 2016 繪圖，SPSS statistics 23.0 軟件進行數據的統(tǒng)計分析，顯著性水平設置為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 傘形花內酯對灰霉菌孢子萌發(fā)率和體外菌落直徑生長的影響

由圖1-A 可知，灰霉菌經8 h 培養(yǎng)后，CK、0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理組的灰霉菌孢子萌發(fā)率分別是92.33%、54.87%和24.54%，表明0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理均能顯著抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)(P＜0.05)。由圖1-B 可知，離體條件下，灰霉菌菌落直徑隨著培養(yǎng)時間的延長而擴展，但2 個濃度傘形花內酯處理組在整個培養(yǎng)過程中均顯著抑制了灰霉菌菌落直徑的擴展(P＜0.05)。

2.2 傘形花內酯處理對獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后病斑面積的影響

由圖2可知，獼猴桃采后果實損傷接種灰霉菌后，果實的病斑面積隨著貯藏時間的延長而不斷擴大。與CK 相比，0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理均顯著抑制整個貯藏期間果實病斑面積的擴展(P＜0.05)；但2 個濃度傘形花內酯處理的抑制效果在接種后4～8 d 無顯著差異。說明適當濃度傘形花內酯處理能夠有效抑制果實損傷接種灰霉菌后的病情發(fā)展。

2.3 傘形花內酯處理對獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后CHT 和GLU 活性的影響

由圖3-A 可知，獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后，CK 和處理組CHT 活性均呈先上升后下降的趨勢；CK和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理組果實CHT 活性在接種后第4 天出現高峰，而0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理組果實的CHT 活性在接種第6 天出現高峰。此外，除1.0 mg·mL-1處理組果實接種后第8 天處，2 個濃度傘形花內酯處理果實的CHT 活性在貯藏期間均顯著高于CK(P＜0.05)。

由圖3-B 可知，CK 獼猴桃果實的GLU 活性不斷上升至第4 天后維持在相對穩(wěn)定的水平，而0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的GLU 活性不斷上升，1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的GLU 活性不斷上升至接種第6 天后開始下降。除1.0 mg·mL-1處理在接種后第8 天外，2 個濃度傘形花內酯處理果實的GLU 活性在貯藏期間均顯著高于CK(P＜0.05)。

2.4 傘形花內酯處理對獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后PAL 和4-CL 活性的影響

由圖4-A 可知，CK 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的PAL 活性變化趨勢相似，呈緩慢上升趨勢；而0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的PAL 活性呈先上升后下降的趨勢，在接種后第4 天達到高峰。除1.0 mg·mL-1處理果實在接種后第8 天外，2 個濃度傘形花內酯處理果實的PAL 活性在貯藏期間均顯著高于CK(P＜0.05)。

由圖4-B 可知，CK 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的4-CL 活性均呈先上升后趨于平緩的趨勢，而0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的4-CL 活性呈波動上升趨勢。0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的4-CL活性在接種后第4 和第8 天顯著高于CK(P＜0.05)，而1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的4-CL 活性在接種后第0、第2、第8 天顯著高于CK(P＜0.05)。說明傘形花內酯處理誘導提高了苯丙烷代謝途徑關鍵酶PAL 和4CL 的活性。

2.5 傘形花內酯處理對獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后POD 和PPO 活性的影響

由圖5-A 可知，CK 果實的POD 活性先緩慢降低(0～6 d)，隨后急劇上升；0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的POD 活性急劇降低在接種第2 天達到最低值，隨后急劇增加至接種第6 天后趨于平衡；1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的POD 活性先呈下降趨勢(0～4 d)，而后急劇增加，在接種第6 天達到最大值，隨后又降低至與CK 同水平。0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的POD 活性在接種后第4～第8 天顯著高于CK，1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理僅在接種后第2和第6 天顯著高于CK(P＜0.05)。

由圖5-B 可知，CK 和0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的PPO 活性在貯藏期間均不斷增加；1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的PPO 活性先呈增加趨勢，接種后第6 天達到最大值，而后降低至初始水平。除1.0 mg·mL-1處理在接種后第8 天外，2 個濃度傘形花內酯處理的果實PPO 活性在貯藏期間均顯著高于CK(P＜0.05)。說明傘形花內酯處理誘導提高了苯丙烷代謝途徑末端氧化酶POD 和PPO 的活性。

2.6 傘形花內酯處理對獼猴桃果實損傷接種灰霉菌后總酚、類黃酮和木質素含量的影響

由圖6-A 可知，CK 果實的總酚含量呈波動上升趨勢；0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的總酚含量的變化趨勢基本一致，在接種后第0～第6 天呈上升趨勢，隨后降低。0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的總酚含量分別在接種后第0、第4、第6 天和第0、第6 天顯著高于CK(P＜0.05)。

由圖6-B 可知，CK 和處理組果實的類黃酮含量在接種后0～2 d 變化不明顯，而后不斷增加；除0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實在接種后第2 天外，2 個濃度處理果實的類黃酮含量在貯藏期間都顯著高于CK(P＜0.05)。

由圖6-C 可知，CK 和0.5 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的木質素含量變化趨勢相似，呈波動變化，而1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理果實的木質素含量在接種前6 d 略微降低，而后急劇增加。0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理的果實木質素含量分別在接種后第4～第8 天和接種后第4、第8 天顯著高于CK(P＜0.05)。說明傘形花內酯處理能夠提高獼猴桃采后果實的總酚、類黃酮和木質素等抗性物質的含量。

3 討論

灰霉菌是獼猴桃灰霉病的主要病原菌，可在獼猴桃果實生長期侵染，也會在果實采后貯藏期間侵染，導致果實腐爛而失去商品價值[20]。有研究表明，傘形花內酯能夠通過破壞灰霉病菌孢子和菌絲體的形態(tài)結構起到抑菌效果[21]。本試驗結果表明，0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理均能顯著抑制灰霉菌孢子的萌發(fā)，且傘形花內酯濃度越高，抑制效果越顯著。此外，2 個濃度的傘形花內酯處理均能顯著抑制灰霉菌體外菌落的擴展，且1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理的抑制效果優(yōu)于0.5 mg·mL-1，這與傘形花內酯對擴展青霉的抑制效果[9]相似，表明傘形花內酯對一些真菌致病菌具有較好的抑菌效果。同時，接種第2 天后，盡管0.5 和1.0 mg·mL-1傘形花內酯處理對損傷接種灰霉菌獼猴桃果實的病斑擴展未表現顯著差異，但2 個濃度處理均能夠有效抑制損傷接種灰霉菌獼猴桃果實的病斑擴展，表明適當濃度范圍的傘形花內酯處理能夠有效控制獼猴桃采后果實灰霉病的病情發(fā)展，降低果實腐爛率。

CHT 和GLU 是采后果實在受到生物或非生物脅迫時所誘導產生一類小分子蛋白，即病程相關蛋白(pathogenesis related protein，PR 蛋白)[22]。研究表明，CHT 和GLU 對真菌細胞壁的降解有協(xié)同作用，兩者能降解真菌細胞壁的主要成分幾丁質和β-1，3-葡聚糖，對病原菌有直接殺傷作用[23]。本研究發(fā)現，2 個濃度傘形花內酯處理均可顯著提高損傷接種灰霉菌后徐香獼猴桃果肉中的CHT 和GLU 活性，表明傘形花內酯處理可能是通過誘導產生PR 蛋白來提高果實的抗病性。

植物可以激活體內苯丙烷代謝來抵御病原菌的侵染，從而增強自身抗病性；其中，PAL 和4CL 是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，其活性高低與寄主抗病強弱密切相關[14，24-25]；POD 和PPO 是苯丙烷途徑的末端相關酶，在抗病性中也發(fā)揮重要的作用[25-26]。研究發(fā)現一些植物誘抗劑提高采后果實的抗病性與其調控果實的苯丙烷代謝相關。例如，甲基水楊酸[27]和褪黑素[28]處理誘導提高番茄等采后果實苯丙烷代謝關鍵酶活性，進而提高了果實對灰霉病的抗性。本研究發(fā)現，與對照相比，傘形花內酯處理不同程度提高了損傷接種灰霉菌獼猴桃果實在貯藏期間的PAL、4CL、PPO 和POD 活性，表明傘形花內酯處理可以通過提高獼猴桃采后果實的苯丙烷代謝相關酶活性來提高果實的抗病力，進而抑制灰霉病的發(fā)展。

多酚和類黃酮等酚類物質是植物體內的次生代謝產物，不僅對病原菌有毒害作用，還能被氧化成毒性更高的醌類物質，進一步毒殺病原菌[29]。木質素是細胞壁的主要成分之一，同時也是苯丙烷類代謝的產物之一，細胞壁的木質化是對病原體有效的物理屏障[14，24]。本研究發(fā)現，傘形花內酯處理能夠提高損傷接種灰霉菌后獼猴桃果實貯藏期間類黃酮含量和貯藏前中期總酚含量，顯著提高貯藏中后期木質素的含量。表明傘形花內酯處理能夠提高這些抗性物質的含量，進而增強果實的抗病性。

4 結論

本研究發(fā)現，外源傘形花內酯能有效抑制灰霉菌孢子萌發(fā)和生長。傘形花內酯處理顯著提高了損傷接種灰霉菌獼猴桃果實中CHT、GLU、PAL、4CL、POD 和PPO 等防御相關酶活性，以及抗性物質總酚、類黃酮和木質素含量，從而誘導獼猴桃采后果實的抗病性。適宜濃度的傘形花內酯處理能夠有效抑制獼猴桃灰霉病的發(fā)展，從而降低獼猴桃果實采后腐爛率，提高果實的貯藏性。