夾竹桃葉片水提液對(duì)細(xì)菌的抑制作用

翟 興 禮

(商丘師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 商丘 476000)

夾竹桃(Nerium indicum)，又名柳葉桃、半年紅，屬夾竹桃科，夾竹桃屬.具有抗煙霧、抗灰塵、抗毒物和凈化空氣、保護(hù)環(huán)境的能力.夾竹桃是最毒的植物之一，包含多種毒素，有些甚至致命.夾竹桃很少有病蟲害，而且其葉、枝、根都可以用于殺蟲［1］.夾竹桃全株有毒，其毒性成分主要是強(qiáng)心甙類物質(zhì)(異熱馬酮、煙酰異熱馬酮、洋地黃毒甙元、厚果酮等).熊英年等曾利用夾竹桃治療畜禽寄生蟲病300 多例［2］.還發(fā)現(xiàn)夾竹桃提取液能用于消滅釘螺［3］以及抑制茭白二化螟［4］和線蟲［5］的生物活性.

研究發(fā)現(xiàn)，夾竹桃對(duì)一些細(xì)菌具有抑菌作用.李萍、譚蕓、龔枕等曾利用夾竹桃研究其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等受試菌種的抑菌作用，結(jié)果表明其均有不同程度的抑菌作用［6］.陸寧海、吳利民、李曉紅等以玉米小斑病菌、小麥紋枯病菌等植物病原菌作為受試菌種，研究夾竹桃的抑菌性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)植物病原菌具有抑菌作用［7］.本實(shí)驗(yàn)以巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌作為受試菌種，采用濾紙片貼片法實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小作為抑菌效果大小的衡量尺度，進(jìn)行夾竹桃葉提取液的抑菌作用研究.以期為夾竹桃的充分、合理的開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 夾竹桃葉的選取

一般于5月下旬至6月中旬，取夾竹桃枝條上部嫩葉片或枝條頂端嫩芽，汁液較多也方便磨碎.試驗(yàn)用夾竹桃采自商丘師范學(xué)院中心花園.

1.1.2 供試菌種

巨大芽孢桿菌(bacillus megatherium)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂粉).

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，研缽，三角瓶，小試管，培養(yǎng)皿，圓形濾紙片(6 mm)等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［8］:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL，pH 7.4－7.6.將各種物質(zhì)加入水中加熱溶解后，分裝于5 個(gè)250 mL 的錐形瓶中，滅菌后備用.

1.2.2 夾竹桃葉提取物的制備

取夾竹桃葉，用自來水洗凈后用蒸餾水沖洗，晾干頁面水分，稱取15 g 于紫外燈下照射20 min［12］.放入滅菌后的研缽中，放適量石英砂于其中，研磨后，加5 mL 無菌蒸餾水浸泡1 h.用四層無菌紗布過濾并擠壓，即得夾竹桃提取液.

夾竹桃水提取液的濃度=夾竹桃葉的質(zhì)量(鮮重)/葉重+加入水的體積，此時(shí)該提取液濃度為75 %.再將75 %的夾竹桃用無菌蒸餾水稀釋成50 %，25 %，5 %三個(gè)濃度，即得到75 %、50 %、25 %、5 %四個(gè)提取液濃度梯度，置于冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.3 提取液濾紙片浸制

將經(jīng)過干熱滅菌的小濾紙片(6 mm)分別放入各濃度的夾竹桃葉提取液中，充分浸泡2 h.

1.2.4 受試菌液的配制

將低溫保藏的巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行斜面活化24 h.分別用接種環(huán)挑取四環(huán)活化后的菌落，加入裝有10 mL無菌水的小試管中，充分震蕩使菌體散開，制成菌懸液備用.

1.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

分別用加液槍取兩種菌懸液0.5 mL 加入到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用涂布棒涂勻.正置30 min 后，將用各濃度夾竹桃提取液浸泡后的濾紙片小心均勻放置到帶菌的培養(yǎng)基平板上，每皿放相同夾竹桃葉提取液濃度的4 片濾紙.每個(gè)濃度提取液做3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn);對(duì)照組兩種菌種各做1 個(gè).放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24－48 h，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，測(cè)量抑菌圈直徑大小，求其平均數(shù).

2 結(jié)果與分析

以巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌為受試菌種，利用4 個(gè)濃度梯度的夾竹桃葉提取液來進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑大小，具體抑制情況見表1.

表1 夾竹桃葉提取液對(duì)巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑(mm)Table 1 Circle diameter of Bacteriostasis effert of water extract from Oleander Leaves on bacillus megatherium

抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，4 個(gè)濃度的夾竹桃葉提取液對(duì)巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度抑制作用.高濃度的提取液具有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，抑菌效果明顯;隨著其濃度的降低，抑菌圈的直徑減小，抑菌程度減弱.

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，夾竹桃葉提取液對(duì)巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均具有殺菌作用.75%的夾竹桃葉提取液對(duì)巨大芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為10.25 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌的最大抑菌圈直徑為9.0 mm，較前者小一些，比較夾竹桃葉提取液對(duì)兩種受試菌種的抑制作用，其對(duì)巨大芽孢桿菌的抑制圈均比對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈大;這表明，相同濃度的夾竹桃葉提取液對(duì)巨大芽孢桿菌的抑菌效果要比對(duì)枯草芽孢桿菌的要高一些.

3 討論

對(duì)于夾竹桃的抑菌作用研究，李昌靈、牛友芽、劉勝貴曾用不同溶劑進(jìn)行夾竹桃葉提取液的抑菌實(shí)驗(yàn);結(jié)果表明，夾竹桃葉的70%乙醇提取液的抑菌效果最為明顯［9］.同時(shí)，譚宏亮、黎鵠志將夾竹桃葉進(jìn)行加熱干燥后，蒸餾水煮沸提取，濃縮后制得提取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，也收得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［10］.本實(shí)驗(yàn)以蒸餾水直接浸泡提取夾竹桃有效成分，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，具有一定的抑菌性;但較之李昌靈、牛友芽、劉勝貴所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，抑菌效果較差.說明不同提取方式對(duì)夾竹桃有效成分的提取效果不同.蒸餾水直接提取效果不佳，可能是用水直接提取有效成分不能充分提取出來，進(jìn)而造成抑菌效果不理想.

夾竹桃以其劇毒性，在殺蟲殺菌方面具有較大作用.同時(shí)其有效成分具有治療心臟病、心力衰竭、閉經(jīng)的作用.生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)非常復(fù)雜，因此一種藥物對(duì)機(jī)體的殺菌作用效果及殺菌機(jī)理都有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.本實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，為夾竹桃的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).

［1］沈宦初，張一賓.生物農(nóng)藥［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［2］熊英年，張吉英，李德山.夾竹桃的殺蟲作用［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，1997(4):41.

［3］曾永鋼，唐萬鵬，胡興宜等.釘螺對(duì)夾竹桃強(qiáng)心總甙毒理作用的反應(yīng)［J］.科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2010(19):128－129.

［4］鄭許松，俞曉平，呂仲賢，等.夾竹桃葉提取物對(duì)茭白二化螟的生物活性［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，15(3):167－171.

［5］王猛，曹福祥，滕濤.夾竹桃提取物對(duì)松材線蟲致死性的研究［J］.湖南林業(yè)科技，2000，33(6):7－8.

［6］李萍，譚蕓，龔枕，王智.夾竹桃葉提取液的抑菌作用研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(11):94－95.

［7］陸寧海，吳利民，李曉紅，等.夾竹桃抑菌活性的初步研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46(6):934－935.

［8］沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版)［M］.北京:高等教育出版社，2006.57－58，100－103.

［9］李昌靈，牛友芽，劉勝貴.夾竹桃葉提取物的抑菌作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36(2):575－577.

［10］譚宏亮，黎鵠志.夾竹桃葉水提取物抑菌作用研究［J］.宜春學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(4):70－71.