微小染色體維持蛋白4在胰腺導管腺癌中的表達及其與預后相關性研究

劉賓 劉輝 李寶玉

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科300211

0 引 言

胰腺癌被稱為“癌中之王”，是一類主要起源于胰腺導管上皮細胞的惡性腫瘤[1]。胰腺癌的惡性程度高，早期診斷困難，起病迅速，是預后最差的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率在全球均高居惡性腫瘤前10 位[2]。中國國家癌癥中心的數(shù)據(jù)表明，2019年我國胰腺癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第10 位，死亡率高居第6 位。按照病理類型，胰腺癌主要分為胰腺導管腺癌（約占80%）、腺鱗癌、腺泡細胞癌等[3]。手術結合放射治療、化學治療是胰腺癌的主要治療手段，但臨床效果欠佳[4]。胰腺癌缺乏顯著的早期癥狀，因此其早期診斷至關重要[5]。

胰腺癌的早期診斷常用標記物包括CEA、CA199、CA242 等，盡管其在一定程度上能預測胰腺癌的發(fā)生，具有一定的早期診斷價值，但特異性均有待提高，并需結合影像學手段加以進一步判斷[6]。為了提高胰腺癌患者的早期診斷率，降低死亡率，仍需發(fā)現(xiàn)更為有效的胰腺癌生物標記物。

微小染色體維持蛋白（minchromosome maintenance proteins，MCM）主要負責染色體功能維持及DNA 復制起始[7]。MCM 蛋白家族高度保守，具有保守的MCM 盒結構域，是一種依賴DNA 的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶[8]。MCM 家族主要包括8 個成員，這些成員能夠形成多聚體而發(fā)揮功能[9]。MCM4 是MCM 家族的一個重要成員，與MCM4 突變相關的疾病主要包括免疫缺陷和家族糖皮質激素缺乏等[10]。近年來，MCM4 對腫瘤的影響已得到廣泛的揭示[11]。MCM4 可作為一種可靠的腫瘤標記物[12]。在多種腫瘤組織中（如膀胱癌及胃癌中），MCM4 均異常表達，并與患者的不良預后及臨床病理特征密切相關[13]。在胃癌中，MCM4 蛋白與腫瘤的分化程度及淋巴轉移有關，低分化癌組織中的MCM4表達高于高分化癌，且淋巴轉移組的MCM4 表達高于未轉移組[14]。然而截至目前，MCM4 與胰腺癌這一高惡性程度腫瘤的潛在關聯(lián)仍不明確。

本文中，通過生物信息學分析與免疫組化分析，探索胰腺癌中MCM4 的表達情況，以及其表達量與臨床病理特征的關系，以便進一步了解MCM4在胰腺癌中的作用，為胰腺癌的發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年3月至2019年3月，天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胃腸外科收治的經(jīng)手術治療的胰腺癌患者76例。其中，男性44例，女性32例，年齡（54.5±5.8）歲。全部病例均經(jīng)過病理證實，術前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級和腫瘤大小等。76例病例中，腫瘤為低級別者35例，高級別者41例；腫瘤大小<4 cm 者28例，≥3.5 cm 者48例。

1.2 主要材料與儀器

MCM4 兔抗人單克隆抗體（ab124836，英國Abcam公司），PV-6001 免疫組化檢測試劑盒、ZLI-9018 二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術有限公司。

RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 免疫組織化學檢測方法

胰腺導管腺癌腫瘤及癌旁組織通過福爾馬林固定，石蠟包埋。包埋后蠟塊標本進行3 μm 切片，進一步進行MCM4 免疫組化染色。切片于75 ℃孵育30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并用梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，80%，75%）水合。水合完畢后使用檸檬酸緩沖液孵育20 min 提取抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min，使反應充分進行。隨后用質量濃度為50 g/L 的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 封閉液封閉30 min。封閉后使用MCM4 抗體孵育2 h，抗體采用1∶100 稀釋。然后切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，通過DAB 法顯色，蘇木素染色細胞核。免疫組化切片于顯微鏡下觀察并拍照采集圖像，根據(jù)腫瘤細胞陽性染色面積和染色強度綜合評價免疫組化結果。

通過染色證實，MCM4 蛋白在腫瘤組織中呈胞漿定位。隨機選取5 個不同的視野，依照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評定。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數(shù)<20%時，記0分；20%～50%時，記1分；50%～70%時，記2分；>70%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的和判斷表達情況，總分范圍為0～6分?？偡譃?～2分為MCM4 低表達，3～6分為MCM4 高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 5.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 在胰腺導管腺癌組織中的表達情況。通過ProteinAtlas數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-MCM4/tissue）分析不同腫瘤組織中MCM4 的表達與患者預后的相關性，并通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫比較胰腺導管腺癌患者MCM4 不同表達組的總生存及無病生存率差異（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM4）。符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，通過卡方檢驗比較臨床病理特征與患者胰腺導管腺癌組織MCM4 表達之間的相關性，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MCM4 的生物信息學分析結果

有研究結果證實，MCM4 在多種腫瘤中異常表達并提示不良預后。因此，通過ProteinAtlas 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 在不同腫瘤中與患者生存期之間的相關性。結果表明，MCM4 的mRNA 水平與多種腫瘤患者的生存期之間具有顯著相關性，包括子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤、肝癌、結腸癌、胰腺癌及腎癌，提示MCM4 可作為相關腫瘤預后的預測因子（圖1）。

圖1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在不同腫瘤組織中與患者預后間的關聯(lián)

通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的mRNA 水平在胰腺導管腺癌組織和正常組織中的表達情況，共分析人胰腺導管腺癌組織179例及對應的癌旁正常組織171例。如圖2 所示，MCM4 的mRNA 在胰腺導管腺癌組織中呈顯著高表達（P<0.05）。

圖2 胰腺導管腺癌中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的mRNA 表達

進一步通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析MCM4 的表達與胰腺導管腺癌患者的預后的潛在關聯(lián)。結果表明，MCM4 的表達與胰腺導管腺癌患者的總生存率及無病生存率均密切相關（圖3）。該結果提示，MCM4 的表達與患者的預后密切相關。

2.2 MCM4 在胰腺導管腺癌組織中的表達

通過免疫組織化學染色方法檢測MCM4 在76例行手術切除的胰腺導管腺癌患者的腫瘤組織及其對應的癌旁組織中MCM4 蛋白表達情況。結果顯示，MCM4 定位于胞漿，其表達量在胰腺導管腺癌組織中明顯高于癌旁正常組織（圖4A）。根據(jù)染色的強度，將胰腺導管腺癌患者分為MCM4 高表達組和MCM4 低表達組。分組后發(fā)現(xiàn)，MCM4 在癌旁正常組織中的表達量顯著降低（圖4B）。

2.3 MCM4 蛋白表達與胰腺導管腺癌患者的臨床病理特征相關

為了進一步明確MCM4 對胰腺導管腺癌的臨床意義，分析比較了MCM4 表達情況與胰腺導管腺癌患者的臨床病理特征之間的關聯(lián)。比較了MCM4高表達組與MCM4 低表達組的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級及腫瘤大小。結果表明，MCM4 的表達水平與胰腺導管腺癌患者的腫瘤大小顯著相關（P=0.038），而與其他的臨床特征，如年齡（P=0.818）、性別（P=0.845）、腫瘤分級（P=0.632）無關（表1）。

3 討論與結論

胰腺癌患者的預后極差，5年總生存率不足5%。行根治性切除術的患者，往往由于腫瘤的轉移及復發(fā)，5年總生存率不到20%[15]。胰腺癌的主要死亡原因包括腫瘤直接導致的并發(fā)癥或胰腺癌術后的并發(fā)癥[16]。如果能對胰腺癌進行早期診斷與治療，患者術后2年的存活率可達40%[2]。早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預后的關鍵，而新興的靶向治療與免疫治療已經(jīng)初見曙光，多種靶向治療藥物開始用于臨床[17]。胰腺癌的早期診斷需要高效且靈敏的生物標記物。作為傳統(tǒng)的胰腺癌標記物，CA199、CEA 等已取得了一定的效果，但其靈敏度與特異性均有待提高[18]。近期研究結果表明，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）在胰腺導管腺癌組織中顯著高表達，且比CA199 的各項指標更加突出，而進一步的臨床實驗仍待進行。本研究中，MCM4 蛋白在胰腺導管腺癌組織中呈現(xiàn)顯著高表達，并與患者的臨床病理特征及不良預后密切相關，相關結果證實MCM4 可作為胰腺導管腺癌的預后預測因子和潛在的生物標記物。

圖3 微小染色體維持蛋白4（MCM4）表達與胰腺導管腺癌患者生存率的相關性

圖4 胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的免疫組化結果

表1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）蛋白表達與胰腺導管腺癌患者臨床病理特征的相關性分析

本研究中，通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)179例胰腺導管腺癌樣本中MCM4 的mRNA 呈顯著高表達，且MCM4 的mRNA 水平與胰腺導管腺癌患者的總生存率及無病生存率密切相關。該結果證實了MCM4 與胰腺導管腺癌患者的預后存在相關性，暗示其可作為胰腺導管腺癌的預后預測因子。此外，免疫組化分析結果顯示，MCM4 在76例胰腺導管腺癌組織樣本中顯著高表達。因此，綜合生物信息學分析和免疫組化分析結果?？梢缘贸鯩CM4 在胰腺導管腺癌中呈現(xiàn)高表達，并暗示MCM4 可作為一個潛在的胰腺導管腺癌生物標記物。

進一步，通過分析免疫組化結果與患者的臨床病理特征之間的關系，發(fā)現(xiàn)MCM4 與胰腺導管腺癌的腫瘤大小顯著相關。這暗示MCM4 在胰腺導管腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。腫瘤的生長包括多個重要階段，如腫瘤細胞的增殖、遷移及新生血管形成等，而失控的細胞增殖是其中的關鍵環(huán)節(jié)。MCM4 的表達與腫瘤大小相關，提示MCM4 可能會對胰腺導管腺癌細胞增殖有影響。下一步需要通過體外實驗加以證實，以便為探索胰腺導管腺癌的有效治療靶點提供新的線索。

MCM4 對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響已有廣泛的報道[19]。作為一個和細胞周期相關的調控基因，MCM4可通過多種手段調控腫瘤的進展。MCM4 的過表達是喉部鱗狀細胞癌的一個潛在的預后標志物[19]。另外，在卵巢癌中，E2F2 可誘導MCM4 的表達上調，并與患者的不良預后顯著相關[13]。在食管腺癌、鱗狀細 胞 癌 和 癌 前 病 變 中，MCM4 與Ki-67、Bmi1 和cyclin E 的表達顯著相關[19-20]。上述這些結果和本研究結果證實了MCM4 可作為多種腫瘤的預后預測因子及潛在的生物標記物。

MCM4 本身對于細胞周期、細胞分裂及DNA復制具有重要的調控作用[10,21-23]。有研究者證實了MCM4、SLD3 和DBF4 在控制DNA 復制進程中具有協(xié)同作用[24-25]。MCM4 是啟動DNA 復制所必須的關鍵基因，是前復制復合體的關鍵組成部分[20,26]。MCM4經(jīng)檢查點激酶ATR 及CDK2 磷酸化后可抑制相關解旋酶活性，進而抑制DNA 復制過程[27]。這暗示MCM4 在腫瘤組織中的異常表達會影響DNA 復制，進一步影響相關腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后。同時，MCM4 在全身多處組織中均廣泛表達，而其對于胰腺導管腺癌的影響是否由于對DNA 復制的調控仍然值得進一步的體內(nèi)外研究加以證實。

綜上，胰腺導管腺癌是一種惡性程度極高且預后極差的腫瘤。MCM4 在人胰腺導管腺癌組織中呈現(xiàn)異常高表達且與胰腺導管腺癌患者的腫瘤大小顯著相關；MCM4 的表達與胰腺導管腺癌患者的預后密切相關。以上結果表明，MCM4 可能是胰腺導管腺癌的潛在生物標記物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突