MCM6在膀胱癌中的表達及其與預(yù)后相關(guān)性研究

胡鐵良 龐亮

天津市職業(yè)病防治院，天津市工人醫(yī)院泌尿外科300011

0 引 言

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率與死亡率，每年約有400 萬新發(fā)病例[1-2]。膀胱癌的病理類型有膀胱尿路上皮癌、鱗狀細胞癌和膀胱腺癌，其中以膀胱尿路上皮癌最常見，約占膀胱癌總數(shù)的90%[3]。膀胱癌的治療主要包括手術(shù)切除、放療、化療及綜合治療等[4]。膀胱癌缺乏顯著的早期癥狀，因此患者往往在就診時已處于進展期[5]。因此，準確而敏感的膀胱癌早期診斷方法具有重要意義。當前，膀胱癌檢測仍以尿細胞學檢查為金標準，而當前已有多種尿液標記物得到確認[6]。對膀胱癌的發(fā)病機制進行研究有助于找到新的更敏感的標記物[7]。同時，由于晚期膀胱癌的高轉(zhuǎn)移性，研究新的膀胱癌標記物及治療手段仍是當務(wù)之急[6]。近年來，膀胱癌的靶向治療已顯示出良好前景，但為了提高膀胱癌患者的生存率，尋找新的預(yù)后預(yù)測因子及治療靶點仍然重要。

微小染色體維持蛋白（minchromosome maintenance proteins, MCM）是一類于20 世紀80年代通過生化手段從酵母中分離得到的蛋白。MCM 主要存在于細胞核中，負責染色體功能維持、DNA 復(fù)制及細胞分裂[8-9]。目前，研究者已發(fā)現(xiàn)6 個MCM 家族蛋白，包括MCM2～MCM7[10]。由于MCM 蛋白在靜止、衰老和分化的細胞中均表達下調(diào)，因此可以作為標記物來識別有增殖能力的細胞[11]。這意味著MCM2～MCM7可以在細胞癌變之前被識別，從而進行早期診斷和治療[12]。MCM6 是MCM 蛋白家族的一個重要成員，參與細胞周期調(diào)控，并影響細胞增殖、遷移等多個細胞過程[13]。MCM6 廣泛影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在多種腫瘤（如肝癌、乳腺癌、胃癌等）中具有重要的調(diào)控作用[14-16]。在子宮內(nèi)膜腺癌中，MCM6 的表達與組織學分級和生存率相關(guān)[17]。MCM6 通過MEK/ERK通路促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移，并可作為識別肝細胞癌早期復(fù)發(fā)的血清生物標志物[15]。MCM6 的過表達與膠質(zhì)瘤患者的生存率密切相關(guān)[18]。盡管MCM6 對腫瘤的影響已有廣泛報道，其在膀胱癌中的表達及對膀胱癌的潛在影響仍不明確。

本研究中，旨在探討MCM6 在膀胱癌組織及相應(yīng)正常組織中的相對表達及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，有助于更好地認識MCM6 在膀胱癌發(fā)展中的作用機制，從而對研究監(jiān)測及治療膀胱癌的新方法有十分重要的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年8月至2019年9月，天津市工人醫(yī)院泌尿外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的膀胱癌患者83例。其中，男性45例，女性38例，年齡59.2 歲±16.9 歲。全部病例均經(jīng)過病理證實，術(shù)前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期和腫瘤分化特征等。83例病例中，腫瘤分期T1～T2 期者39例，T3～T4 期者44例；腫瘤分化低級別者31例，高級別者52例。

1.2 主要材料與儀器

MCM6 兔抗人單克隆抗體（ab201683，英國Abcam 公司），PV-6001 免疫組化檢測試劑盒、ZLI-9018 二氨聯(lián)苯胺（diamio benzidine，DAB）顯色試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.3 免疫組織化學檢測方法

膀胱癌腫瘤及癌旁組織通過福爾馬林固定及石蠟包埋。包埋后的蠟塊標本進行5 μm 切片，進一步進行MCM6 免疫組化染色。切片于75 ℃孵育30 min，隨后用二甲苯脫蠟，并通過梯度乙醇溶液（100%，100%，95%，85%，80%，75%）進行水合。水合完畢后，使用檸檬酸緩沖液孵育25 min 修復(fù)抗原，并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶5 min，使反應(yīng)充分進行。隨后用質(zhì)量濃度為50 g/L 的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液封閉30 min。封閉后使用MCM6 抗體孵育2 h，抗體采用1∶200 稀釋。然后，切片用生物素化的二抗孵育1.5 h，使用DAB 法顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。免疫組化切片于顯微鏡下觀察拍照采集圖像，根據(jù)腫瘤細胞陽性染色面積和染色強度綜合評價免疫組化結(jié)果。

通過染色證實，MCM6 蛋白在腫瘤組織中呈核定位。隨機選取5 個不同的視野，依照陽性細胞在總細胞數(shù)中的比例進行評定。陽性細胞比例評分標準：腫瘤細胞陽性百分數(shù)<10%時，記0分；10%～40%時，記1分；40%～70%時，記2分；>70%時，記3分。陽性染色強度評分標準：陰性染色記0分；弱陽性染色記1分；中陽性染色記2分；強陽性染色記3分。以陽性細胞百分比評分和染色強度評分的和判斷表達情況，總分范圍為0～6分?？偡譃?～2分為MCM6 低表達，3～6分為MCM6 高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 6.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。通過基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA） 數(shù)據(jù)庫分析MCM6 的mRNA 在膀胱癌組織中的水平。通過ProteinAtlas 數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000104738-MCM6/tissue）分析不同腫瘤組織中MCM6 的表達與患者預(yù)后的相關(guān)性，并通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫比較MCM6不同表達組膀胱癌患者的總生存及無病生存率差異（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM6）。符合正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差（Mean±SD）表示，通過卡方檢驗比較臨床病理特征與患者膀胱癌和正常癌旁組織中MCM6 表達之間的相關(guān)性，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCM6 在常見腫瘤中的表達

為探究MCM6 對膀胱癌的作用，首先通過ProteinAtlas 數(shù)據(jù)庫分析MCM6 在不同腫瘤中的表達水平。結(jié)果表明，MCM6 蛋白在多種腫瘤組織中高表達，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌（圖1A）。進一步通過生物信息學分析方法發(fā)現(xiàn)MCM6 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，如結(jié)直腸癌、頭頸癌、甲狀腺癌等（圖1B）。

圖1 ProteinAtlas 數(shù)據(jù)庫分析微小染色體維持蛋白6（MCM6）在不同腫瘤組織中的表達水平

2.2 生物信息學分析結(jié)果

通過GPEIA分析MCM6 的mRNA 在膀胱癌組織和正常組織中的表達情況，共分析膀胱癌組織404例及正常組織28例。結(jié)果表明，MCM6 的mRNA 在膀胱癌組織中顯著高表達（P<0.05），如圖2 所示。

圖2 膀胱癌中微小染色體維持蛋白6（MCM6）的mRNA 表達

為了進一步證明MCM6 在膀胱癌進展演變中發(fā)揮的作用，利用Kaplan-Meier分析MCM6 與膀胱癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果表明，MCM6 表達水平與患者的總生存率（P=0.036）和無病生存率（P=0.01）均具有相關(guān)性（圖3A 和圖3B）。上述結(jié)果提示，MCM6 的表達水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。

2.3 MCM6 在膀胱癌組織中的表達

為了探究MCM6 在膀胱癌的進展中的角色。本研究中，運用免疫組織化學染色方法檢測83例膀胱癌組織中的MCM6 的表達情況。結(jié)果顯示，MCM6主要定位于細胞核，其表達量在膀胱癌組織中明顯高于癌旁正常組織（圖4A）。根據(jù)染色的強度，將膀胱癌患者分為MCM6 高表達組和MCM6 低表達組。分組后發(fā)現(xiàn)，MCM6 在癌旁正常組織中的表達量顯著降低（圖4B）。

2.4 MCM6 蛋白表達水平與膀胱癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性

為了進一步明確MCM6 對膀胱癌的臨床意義，分析比較了MCM6 高表達組和MCM6 低表達組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤分級。結(jié)果表明，MCM6 的表達水平與膀胱癌患者的腫瘤分期相關(guān)（P=0.025），而與年齡（P=0.872）、性別（P=0.903）、腫瘤分級（P=0.923）無關(guān)（表1）。

圖3 微小染色體維持蛋白6（MCM6）表達與膀胱癌患者生存率的相關(guān)性

圖4 膀胱癌組織和癌旁正常組織中微小染色體維持蛋白6（MCM6）的免疫組化結(jié)果

表1 微小染色體維持蛋白6（MCM6）蛋白表達與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

近年來，膀胱癌的發(fā)病率及死亡率居高不下，主要因為膀胱癌缺乏顯著的早期癥狀，進展迅速，且缺乏有效的治療方法。早期診斷和靶向治療是提高膀胱癌生存和改善其預(yù)后的關(guān)鍵手段，膀胱癌的早期診斷能顯著提高膀胱癌患者的生存率[2]。但早期診斷需要高效靈敏的生物標記物，并需要結(jié)合影像學、尿細胞學手段進行綜合判斷[7]。近年來，雖然研究者發(fā)現(xiàn)了一些膀胱癌早期診斷生物標記物，其中部分已用于臨床診斷，但其靈敏度及特異性仍有待提高[5]。本研究結(jié)果顯示，MCM6 在膀胱癌組織中顯著高表達，并提示不良預(yù)后。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MCM6 與患者的臨床病理特征相關(guān)。上述結(jié)果提示MCM6 可作為潛在的膀胱癌生物標記物。

在本研究中，通過檢測GEPIA 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的MCM6 的mRNA 表達水平顯著高于正常膀胱組織，且MCM6 的mRNA 水平與膀胱癌患者的總生存率及無病生存率顯著相關(guān)，提示MCM6可作為膀胱癌的預(yù)后預(yù)測因子。免疫組化結(jié)果也顯示膀胱癌組織樣本中，MCM6 蛋白呈顯著高表達。通過進一步對免疫組化的染色結(jié)果進行評分分組，并在分組后分析不同MCM6 表達水平患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)MCM6 與膀胱癌的腫瘤分期密切相關(guān)。腫瘤分期是腫瘤惡性程度的一個重要指標，這提示MCM6 在膀胱癌的進展中可能具有重要的調(diào)控作用。在膀胱癌患者中，細胞增殖、細胞遷移的失控會顯著促進膀胱癌的進展[19]。本研究中，MCM6 影響膀胱癌患者的腫瘤分期，暗示MCM6 可能會對膀胱細胞增殖、遷移及侵襲有影響。這需要開展一系列體外實驗，以揭示MCM6 對膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲等過程的影響，為膀胱癌的靶向治療提供新的線索。

MCM6 對于多種腫瘤具有廣泛的影響，包括乳腺癌、胃癌、肝癌等[14-16]。MCM6 在這些腫瘤中通過不同的調(diào)控方式影響腫瘤的進展。在肝細胞癌中，MCM6 主要通過調(diào)控細胞周期而影響肝細胞癌的進展[20]。研究結(jié)果表明，MCM6 能夠參與非小細胞肺癌的進展并提示不良預(yù)后，但其作用機制有待進一步研究[21]。在腦膜瘤中，MCM6 蛋白的表達與組織學分級和臨床結(jié)果密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果也證實，MCM6在膀胱癌組織中異常高表達，并與患者預(yù)后和臨床病理特征相關(guān)。但是，MCM6 通過何種方式調(diào)控腫瘤的進展，仍然值得進一步研究。

根據(jù)文獻報道，MCM6 主要定位于細胞核[13]，這與本研究的免疫組化染色結(jié)果相一致。MCM6 在細胞核中的主要功能是維持MCM 復(fù)合體的穩(wěn)定，并進一步保證DNA 復(fù)制及細胞分裂的正常進行[13]。因此，MCM6 的異常表達會導致細胞周期及增殖的異常，因此會導致腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移[20]。MCM6 與患者的臨床病理特征有關(guān)，可能是由于其核定位影響了相關(guān)細胞功能。除了MCM6 之外，MCM 家族其他的蛋白成員均在不同腫瘤組織中存在異常表達的情況，而這些蛋白在其他腫瘤組織中也能夠反映患者預(yù)后，有些則參與腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移[9]。例如，MCM2對于乳腺癌的預(yù)后有明顯的提示作用[23]，而MCM3在結(jié)直腸癌中高表達，并能夠調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲[24]。上述研究結(jié)果和本研究的結(jié)果，進一步證實MCM 家族蛋白可作為腫瘤的預(yù)后預(yù)測因子。

綜上，膀胱癌是一種普遍的且具有高轉(zhuǎn)移性的腫瘤，MCM6 在膀胱癌組織中顯著高表達，并與患者的腫瘤分期顯著相關(guān)，此外MCM6 的表達與膀胱癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，提示MCM6 可作為膀胱癌潛在的預(yù)后預(yù)測因子。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突