醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚在大鼠鼻黏膜的吸收研究

喬麗菲+孫承韜+李煌+徐偉+褚克丹+闕金花+鄭健

摘要：目的 通過對醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚的大鼠鼻黏膜吸收進行研究，評價該藥的黏膜吸收情況和劑型選擇的合理性。方法 通過大鼠鼻腔給藥試驗，對不同時間點丹皮酚的血藥濃度進行測定。結(jié)果 大鼠鼻腔給予醒鼻微乳溫敏凝膠后，丹皮酚的生物利用度為78.68%，達到最大濃度（Cmax）0.340 4 ?g/mL的時間為3 min，平均滯留時間為9.23 h；鼻腔給藥的血藥濃度達到Cmax后的變化情況與尾靜脈注射丹皮酚類似；丹皮酚的血藥濃度數(shù)據(jù)符合二室模型，權(quán)重為W=1。結(jié)論 醒鼻微乳溫敏凝膠經(jīng)鼻給藥生物利用度較高，劑型選擇合理。

關鍵詞：醒鼻微乳溫敏凝膠；丹皮酚；鼻腔吸收

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.022

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0088-04

Study on Nasal Mucosa Absorption of Paeonol of Xingbi Microemulsion-based Thermo- sensitive Gel in Rats QIAO Li-fei1， SUN Cheng-tao1， LI Huang1， XU Wei1， CHU Ke-dan1， QUE Jin-hua1， ZHENG Jian2 （1. College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China）

Abstract： Objective To study the nasal mucosa absorption of paeonol of Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel in rats； To evaluate the nasal mucosa absorption of medicine and the rationality of preparation form. Methods According to the nasal administration method， the blood medicine concentration of paeonol was determined at different time points. Results The nasal administration bioavailability of paeonol in Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel was 78.68%， the plasma concentration reached the maximum （0.340 4 ?g/mL） after 3 min of administration， and the average residence time was 9.23 h. After reaching Cmax， The plasma concentration changed similar to intravenous administration of paeonol. The concentration data of paeonol in plasma was consistent with a two-compartment model， with a weight of 1. Conclusion Xingbi microemulsion-based thermo- sensitive gel has a higher bioavailability， and the preparation form was reasonable.

Key words： Xingbi microemulsion-based thermo-sensitive gel； paeonol； nasal absorption

醒鼻方是福建省人民醫(yī)院名老中醫(yī)黃守林主任的鼻腔局部用藥經(jīng)驗方，其主要組成為徐長卿、冰片等，具有疏風清熱、開竅醒鼻等功效，臨床和藥理研究均表明其對變應性鼻炎療效顯著[1-6]。方中君藥徐長卿具有祛風化濕、止痛止癢等功效，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗變態(tài)反應、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛等作用[7-8]。本課題組將醒鼻方制成溫敏凝膠劑[9-11]，制劑以液體形式滴入鼻腔后，在鼻腔溫度下膠凝成半固體，粘附在鼻黏膜上，滯留性、黏著性明顯增強，能夠有效防止藥物流失，延長藥物的作用時間，提高藥物的生物利用度，同時也增強了患者用

藥的順應性。在此基礎上，本研究采用大鼠體內(nèi)實驗法研究醒鼻微乳溫敏凝膠中丹皮酚的吸收動力學，旨在評價藥物的鼻黏膜吸收情況，為中藥新藥開發(fā)和微乳溫敏外用凝膠劑型的研發(fā)提供參考。

1 材料

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），湘儀H-2050R高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），QL-861渦旋振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），XS105電子分析天平（METTLER TOLEDO）。

丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110708-200506），中藥醒鼻微乳溫敏凝膠（自制，批號20130712），丹皮酚注射液（自制，批號20130715），生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司），甲醇為色譜純，水為自制超純水，其余試劑均為分析純。

SD大鼠18只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，6～8周齡，SPF級，上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SCXK（hu）2007-0005，飼養(yǎng)環(huán)境室溫23～25 ℃，濕度50%～70%，光照12 h明暗交替，喂以SPF級大鼠標準飼料，水經(jīng)無菌過濾處理，正常攝水，分籠喂養(yǎng)。endprint

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取丹皮酚對照品7 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為284.80 ?g/mL的丹皮酚對照品貯備液；精密移取貯備液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，即得14.24 ?g/mL的丹皮酚對照品溶液。

2.1.2 內(nèi)標溶液 取肉桂酸對照品6 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，即得濃度為312.00 ?g/mL的肉桂酸內(nèi)標貯備液；精密移取貯備液1 mL至20 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，即得15.60 ?g/mL的肉桂酸內(nèi)標溶液。

2.2 分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-水（60∶40）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：274 nm；進樣量：10 ?L；柱溫：30 ℃；采集時間：15 min。

2.2.2 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 ?L，加入內(nèi)標溶液2 ?L，加入甲醇200 ?L，渦旋混合30 s，14 000 r/min離心10 min，分離上清液，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 專屬性考察 取大鼠空白血漿100 ?L加肉桂酸內(nèi)標溶液和甲醇各2 ?L、空白血漿100 ?L加丹皮酚對照品溶液和肉桂酸內(nèi)標溶液各2 ?L、含藥血漿100 ?L加肉桂酸內(nèi)標溶液和甲醇2 ?L，分別按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣。色譜圖見圖1。結(jié)果表明，丹皮酚峰與內(nèi)標峰分離良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.2.4 線性關系考察 分別取“2.1.1”項下濃度為284.80 ?g/mL的丹皮酚對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL至20 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，配制得濃度分別為1.42、2.85、7.12、14.24、28.48、71.20、142.40 ?g/mL的系列丹皮酚對照品溶液；取100 ?L空白血漿7份，分別加2 ?L上述系列對照品溶液，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以丹皮酚濃度對丹皮酚和內(nèi)標峰面積比值進行線性回歸，得回歸方程Y=2.786 7X+0.026 4（r=0.998 7）。結(jié)果表明，丹皮酚血藥濃度在0.028 5～2.850 0 ?g/mL范圍內(nèi)與峰面積和內(nèi)標峰面積比值線性關系良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

2.2.5.1 提取回收率 取100 ?L空白血漿6份，分別加入濃度為2.850 0 ?g/mL（低濃度）、0.285 0 ?g/mL（中濃度）、1.424 0 ?g/mL（高濃度）的丹皮酚對照品溶液2 ?L，按“2.2.2”項下方法處理后進樣，另取與配制對照品血漿相同的丹皮酚對照品溶液，用流動相配制成相應濃度的丹皮酚溶液，不經(jīng)處理直接進樣[12]，將2組峰面積進行比較，測得低、中、高濃度丹皮酚血漿的平均提取回收率分別為73.71%±7.58% （n=6）、77.93%±6.77%（n=6）、73.93%±6.63%（n=6），RSD分別為2.86%、3.15%、2.95%。

2.2.5.2 方法回收率 另取100 ?L空白血漿6份，分別加入2 ?L低、中、高濃度丹皮酚對照品溶液，按“2.2.2”項下方法處理后進樣，將丹皮酚和內(nèi)標峰面積比值代入“2.2.4”項下標準曲線，計算丹皮酚濃度及回收率[12]，測得低、中、高濃度丹皮酚的方法回收率分別為85.92%±4.41%（n=6）、87.70%±2.59%（n=6）、86.62%±2.20%（n=6），RSD分別為2.53%、2.37%、2.32%。

2.2.6 精密度試驗

2.2.6.1 方法精密度試驗 制備丹皮酚血藥濃度為0.285 0 ?g/mL的樣品，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下連續(xù)測定6次，計算得丹皮酚峰面積與內(nèi)標峰面積比值RSD=1.18%，表明HPLC測定丹皮酚血藥濃度的精密度良好。

2.2.6.2 日內(nèi)精密度 分別取低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 ?g/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，按“2.2.2”項下方法處理，于1 d內(nèi)，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算得低、中、高質(zhì)量濃度樣品丹皮酚峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為10.19 %、8.27 %、6.54 %。

2.2.6.3 日間精密度 連續(xù)3 d制備低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 ?g/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，共 3批，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算得3批低、中、高質(zhì)量濃度樣品丹皮酚峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為13.23 %、9.34 %、6.87 %。

2.2.7 重復性試驗 平行制備丹皮酚血藥濃度為0.285 0 ?g/mL的樣品6份，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算得丹皮酚峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD=1.88%，表明重復性良好。

2.2.8 檢測限與定量限 通過LC-20A高效液相色譜工作站，測得丹皮酚血漿樣品的檢測限（S/N=3）為0.014 24 ?g/mL。按“2.2.5.1”項下方法計算5份濃度為0.028 5 ?g/mL的丹皮酚血漿樣品的提取回收率為82.32%，RSD=16.36 %。因此，確定定量限（S/N>10）為0.028 5 ?g/mL。

2.2.9 不同溫度的穩(wěn)定性試驗 分別取低、中、高濃度（0.057 0、0.285 0、1.424 0 ?g/mL）的丹皮酚血漿樣品各5份，置室溫1、2、4、6、24 h及1、2、4、7、14 d后取樣，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算6 h內(nèi)及6 d內(nèi)低、中、高質(zhì)量濃度的丹皮酚血漿樣品中丹皮酚峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD。同法考察丹皮酚血漿樣品在4 ℃、-20 ℃的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。丹皮酚血漿樣品在室溫下放置，其含量變化較大；4 ℃放置14 d，含量略有變化；-20 ℃放置14 d，含量基本穩(wěn)定。所以樣品放置于-20 ℃保存，2周內(nèi)測定。endprint

2.3 醒鼻微乳溫敏凝膠的大鼠鼻腔吸收動力學

2.3.1 丹皮酚注射液的配制 首先配制88%氯化鈉注射液、10%乙醇和2 %吐溫-80的混合溶液，再用上述混合溶液配制濃度為2.6 mg/mL的丹皮酚溶液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得丹皮酚注射液。

2.3.2 大鼠鼻腔吸收實驗 將18只SD大鼠隨機分為空白組、丹皮酚注射液組、醒鼻微乳溫敏凝膠組，實驗前禁食不禁水12 h。動物用15%烏拉坦（5 mL/kg）淺度麻醉后，空白組和醒鼻微乳溫敏凝膠組分別經(jīng)鼻腔給予生理鹽水和醒鼻微乳溫敏凝膠（50 mg×2，約47 ?L×2，丹皮酚含量2.74%，凝膠給藥劑量0.4 g/kg），丹皮酚注射液組經(jīng)尾靜脈注射丹皮酚注射液0.1 mL（丹皮酚給藥劑量1.04 mg/kg），給藥后0.017、0.05、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、8、12、24 h眼眶取血0.3～0.5 mL于含肝素的采血管中，12 000 r/min離心10 min，分離上清液，得血漿，取100 ?L，按“2.2.2”項下方法處理，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，并按“2.2.4”項下標準曲線計算血漿樣品中丹皮酚的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線（見圖2）。用DAS1.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)，主要藥動學參數(shù)見表2。由結(jié)果可知，醒鼻微乳溫敏凝膠大鼠鼻腔給藥后，丹皮酚的生物利用度為78.68%，達到最大濃度（Cmax）0.340 4 ?g/mL的時間為3 min；平均滯留時間為9.23 h，大鼠尾靜脈注射丹皮酚的平均滯留時間為8.89 h；鼻腔給藥的血藥濃度在達到Cmax之后，變化情況與尾靜脈注射丹皮酚類似；丹皮酚的血藥濃度數(shù)據(jù)均符合二室模型，權(quán)重為W=1。

3 討論

本研究比較了甲醇和乙腈的除蛋白效果，發(fā)現(xiàn)甲醇處理后的血漿樣品丹皮酚峰高于乙腈處理后的血漿樣品丹皮酚峰，而且溶劑峰低于乙腈處理后的血漿樣品的溶劑峰，因此，本試驗選用甲醇除蛋白。

測定血漿樣品中的成分時，本研究比較了有機試劑沉淀蛋白后直接離心與揮干有機試劑再定容2種方法處理生物樣品的丹皮酚回收率，發(fā)現(xiàn)加入2倍血漿量的甲醇能夠達到較高的回收率，原因可能為丹皮酚為易揮發(fā)成分，易在揮干有機試劑時損失。

醒鼻微乳溫敏凝膠常溫下為有一定黏度的可流動液體，不易直接測量體積，因此，在醒鼻微乳溫敏凝膠的制備及大鼠鼻腔給藥時，均通過質(zhì)量來確定其取樣量。

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