類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞增殖及巨自噬的表達水平

邵鑫　蔣先虹　王瑞　蒲強紅　劉福

【摘 要】目的：探討體外原代培養(yǎng)的類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（RA-FLS）中是否存在巨自噬現(xiàn)象以及在類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）中的發(fā)病機制。方法：培養(yǎng)原代RA-FLS，以骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織中培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（OA-FLS）作為對照組。采用MTT法檢測細胞增殖活力;流式細胞儀檢測細胞凋亡;采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）、蛋白免疫印跡法（Western Blot）分別檢測2組細胞中巨自噬標志性因子LC3、P62 mRNA及蛋白的相對表達水平，激光共聚焦顯微鏡檢測LC3、P62蛋白的表達。結(jié)果：從患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織中成功分離、培養(yǎng)出RA-FLS與OA-FLS，MTT結(jié)果顯示，RA-FLS增殖活力明顯強于OA-FLS;流式細胞儀結(jié)果顯示，RA-FLS的細胞凋亡減少;RT-qPCR、Western Blot結(jié)果表明，RA-FLS與OA-FLS相比，LC3 mRNA及蛋白的相對表達水平升高、P62 mRNA及蛋白的相對表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，RA-FLS中LC3表達更高，P62表達更低。結(jié)論：RA-FLS中LC3 mRNA及蛋白的相對表達水平明顯增高，P62 mRNA及蛋白的相對表達水平顯著降低，提示RA中巨自噬水平活化，這可能是導(dǎo)致RA-FLS出現(xiàn)凋亡抵抗，增殖活性明顯高于OA-FLS的潛在原因。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風濕;骨關(guān)節(jié)炎;滑膜成纖維細胞;巨自噬;LC3;P62

Proliferation and Expression of Macroautophagy in Synovial Fibroblasts of Rheumatoid Arthritis

SHAO Xin，JIANG Xian-hong，WANG Rui，PU Qiang-hong，LIU Fu

【ABSTRACT】Objective：To investigate the existence of macroautophagy in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts（RA-FLS）in vitro and its pathogenesis.Methods：Primary RA-FLS were cultured，and OA-FLS were used as a control group.MTT was used to detect cell proliferation activity;flow cytometry was used to detect cell apoptosis;RT-qPCR and Western Blot were used to detect the relative expression levels of LC3，P62 mRNA and protein in the two groups;and laser confocal microscopy was used to detect the expression levels of LC3 and P62.Results：RA-FLS and OA-FLS were successfully isolated and cultured from synovial tissue of knee joint.MTT results showed that the proliferation activity of RA-FLS was significantly stronger than that of OA-FLS.Flow cytometry results showed that the apoptosis of RA-FLS was reduced;RT-qPCR and Western Blot results showed that compared with OA-FLS，the relative expression levels of LC3 mRNA and protein of RA-FLS were higher，and P62 protein of RA-FLS was lower.The difference was statistically significant（P < 0.05）.Laser confocal microscopy showed that LC3 expression was higher and P62 expression was lower in RA-FLS.Conclusion：The relative expression levels of LC3 mRNA and protein in RA-FLS were significantly increased，while the relative expression levels of P62 mRNA and protein in RA-FLS were significantly decreased，suggesting that the level of macroautophagy was activated in RA，which may be the potential reason for the apoptosis resistance and proliferation activity of RA-FLS being significantly higher than those of OA-FLS.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;osteoarthritis;synovial fibroblasts;macroautophagy;LC3;P62

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）主要病理特征為滑膜增生、血管翳形成及軟骨破壞，最終可致殘疾和死亡。國內(nèi)調(diào)查結(jié)果顯示，RA等關(guān)節(jié)疾病和腦血管病是我國兩大主要致殘原因[1]。近年來，隨著對本病認識的加深和新治療方法的出現(xiàn)，其預(yù)后得到明顯的改善，但總預(yù)后仍不容樂觀，RA的發(fā)病機制至今仍未完全明確[2]。巨自噬過程在自身免疫性疾病中的作用逐漸成為研究熱點，大量研究表明巨自噬在RA發(fā)病機制、病程進展中占有關(guān)鍵性地位[3]。類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（RA-FLS）是一種以腫瘤樣方式異常增殖的細胞，細胞活性增強，凋亡減少，導(dǎo)致滑膜異常增生，這在RA的發(fā)病機理中起關(guān)鍵作用[4]。巨自噬通過形成雙膜囊泡（稱為自噬體）而發(fā)生，是一個“自食”過程，該過程中有一系列自噬相關(guān)蛋白共同參與周密調(diào)控，此過程維持了細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡[5]。近年來，巨自噬在RA中發(fā)揮的作用受到廣泛關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)，巨自噬與RA的發(fā)病相關(guān)，并對其機制進行探索[6]。通常情況下，自噬是在應(yīng)激條件下促進細胞存活的一種調(diào)節(jié)方式[7]。本研究檢測巨自噬標志性因子P62、LC3在RA-FLS中的表達水平，初步探討RA的發(fā)病機制。

1 實驗材料

1.1 對象與資料 收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科住院部RA患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，培養(yǎng)原代RA-FLS。同時收集骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，分離、培養(yǎng)原代骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞（OA-FLS）作為對照。本研究獲得川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均知情并同意參與。

1.2 主要儀器 倒置顯微鏡（上海OLYMPUS公司）;超微量紫外分光光度計（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）;全波長全自動酶標儀（瑞士Tecan公司）;LightCycler96實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）;凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）;脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;青鏈霉素（美國Hyclone公司）;Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司）;MTT（上海碧云天生物科技有限公司）;PCR引物合成（生工生物工程上海股份有限公司）;RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟（北京索萊寶科技有限公司）;一抗稀釋液（上海碧云天生物科技有限公司）;Trizol（美國Ambion公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國QIAGEN公司）;脫脂奶粉（北京索萊寶科技有限公司）;PVDF膜（美國Cell Signaling Technology公司）;鼠抗人β-actin單克隆抗體（成都ZenBioScience公司）;兔抗人LC3單克隆抗體、兔抗人P62單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）;辣根過氧化物酶標記的兔抗、辣根過氧化物酶標記的鼠抗（成都ZenBioScience公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo Fisher公司）;FITC標記的兔抗、TRITC標記的兔抗（成都ZenBioScience公司）;Annexin V / FITC凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 原代細胞培養(yǎng) RA與OA患者的滑膜組織取出后，立即放入無菌磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中帶入超凈工作臺，用無菌剪剪成1 mm3體積的小塊，加入3倍體積4 mg·mL-1的Ⅱ型膠原酶，放入37 ℃孵箱中消化4 h，過200目無菌篩網(wǎng)，轉(zhuǎn)移到25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。取第3～7代較純的RA-FLS與OA-FLS用于后續(xù)實驗研究。

2.2 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期細胞RA-FLS與OA-FLS，消化離心后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液密度至2×104個·mL-1，每孔接種100 μL

于96孔板，時間梯度為1，2，3，4，5，6，7 d。另設(shè)空白對照組（無細胞組）扣除背景影響，每組設(shè)置6個復(fù)孔，四周用PBS補充，防止加樣孔液體揮發(fā)過快導(dǎo)致差異;過夜待細胞貼壁成形后棄去原培養(yǎng)基，按時間梯度分別檢測細胞的增殖活力，未檢測孔每隔3 d換液1次;每孔加入5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置孵箱中繼續(xù)孵育4 h;棄液，每孔加入DMSO溶液150 μL，避光溶解10 min;用酶標儀測定各孔在570 nm波長處的吸光度（OD值）。細胞增殖活力（%）=[（給藥組細胞OD值-空白組OD值）/（對照組細胞OD值-空白組OD值）]×100%。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞RA-FLS與OA-FLS，消化離心后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液密度至1×105個·mL-1，接種于6孔板中，每孔2 mL。過夜待細胞貼壁，用PBS洗滌后收集細胞，加入標記熒光素AnnexinV-FITC 5 μL混勻后，加入PI染色試劑5 μL，混勻后室溫避光反應(yīng)5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.4 實時熒光定量PCR檢測LC3、P62 mRNA的表達水平 細胞接種同2.3，用Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度。根據(jù)RNA濃度檢測的結(jié)果，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)試劑說明進行實時定量PCR反應(yīng)。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)20 s，40個循環(huán)。△△CT=△CT[CT（對照組目的基因）-CT（對照組內(nèi)參基因）]-△CT[CT（實驗組目的基因）-CT（實驗組內(nèi)參基因）]。內(nèi)參β-actin和目的基因序列見表1。

2.5 Western Blot檢測LC3、P62蛋白的表達水平 細胞接種及處理同2.3、2.4，用蛋白裂解液充分裂解細胞中的蛋白至少30 min，BSA法測定蛋白濃度，金屬浴95 ℃變性蛋白10 min，然后進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，孵育一抗，孵育二抗，顯影成像，結(jié)果用IMage J分析。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 MTT檢測結(jié)果 倒置顯微鏡下分別觀察

RA-FLS與OA-FLS的細胞形態(tài)，原代滑膜細胞簇集生長，傳至第3代后細胞較純，分散式生長，均為長梭形，可見RA-FLS比OA-FLS更為細長。見圖1。MTT結(jié)果顯示，RA-FLS在1～3 d時生長速度最快，5～7 d基本達到增殖平衡，OA-FLS細胞生長速度明顯低于RA-FLS。見圖2。

3.2 流式細胞儀檢測結(jié)果 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，RA-FLS組凋亡率為（6.4700±1.8474）%，OA-FLS組為（11.7500±1.3452）%，2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

3.3 RT-qPCR結(jié)果 RA-FLS與OA-FLS均存在LC3 mRNA、P62 mRNA的表達，RT-qPCR結(jié)果顯示，RA-FLS組LC3 mRNA的相對表達量顯著高于OA-FLS組（P < 0.05）;RA-FLS組P62 mRNA的相對表達量明顯低于OA-FLS組（P < 0.05）。見表2。

3.4 Western Blot結(jié)果 RA-FLS與OA-FLS均存在LC3蛋白、P62蛋白的表達，Western Blot結(jié)果顯示，RA-FLS組LC3-Ⅱ蛋白的相對表達量明顯低于OA-FLS組（P < 0.05）;RA-FLS組P62蛋白的相對表達量顯著高于OA-FLS組（P < 0.05）。見表3。

3.5 激光共聚焦檢測結(jié)果 激光共聚焦檢測結(jié)果顯示，DAPI藍色熒光代表細胞核，F(xiàn)ITC綠色熒光代表LC3蛋白，TRITC紅色熒光代表P62蛋白。與OA-FLS比較，RA-FLS中LC3綠色熒光斑點明顯增多，P62紅色熒光斑點減少，表明自噬途徑被激活。見圖3。

4 討 論

位于滑膜內(nèi)膜層的RA-FLS通過產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-8等細胞因子和有助于軟骨破壞的蛋白酶在RA中起關(guān)鍵作用[8]。此外，RA-FLS參與了骨侵蝕性血管翳的形成和關(guān)節(jié)的血管新生，這些均與RA-FLS的快速增殖、凋亡減少密切相關(guān)[8]。不同RA患者的病情不同，經(jīng)處理后的細胞株不足以說明RA患者體內(nèi)的實際病理情況，以原代分離培養(yǎng)的

RA-FLS作為實驗對象更具有代表性，本研究通過Ⅱ型膠原酶消化法成功從患者滑膜組織中培養(yǎng)原代滑膜細胞[9]。筆者首先通過MTT檢測到RA-FLS的細胞增殖活力顯著強于OA-FLS，這與SUN等[10-11]的研究結(jié)果一致，提示直接靶向RA-FLS是改善RA疾病進程的一種可靠思路。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，與OA-FLS相比，RA-FLS出現(xiàn)凋亡抵抗。

接著，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，LC3、P62 mRNA的表達在RA-FLS中顯著增加。LC3常被作為巨自噬的標志性因子，P62中LIR結(jié)構(gòu)域負責識別并與自噬受體蛋白LC3結(jié)合，保證了巨自噬的正常進行。巨自噬是溶酶體吞噬和降解胞漿內(nèi)含物的過程[12]。巨自噬的啟動受Unc51樣激酶1復(fù)合物的調(diào)控[13]，其中最關(guān)鍵的步驟是通過微管LC3與磷脂酰乙醇胺的綴合形成自噬體[14]。LC3被半胱氨酸蛋白酶Atg4裂解以產(chǎn)生胞質(zhì)形式的LC3-Ⅰ，在被Atg7激活后，被轉(zhuǎn)移到Atg3，以便與藻紅蛋白的綴合物形式被改變，稱為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是測試自噬活性的最常用標記[15]。進一步通過SDS-PAGE和免疫印跡分析后發(fā)現(xiàn)，在RA-FLS與OA-FLS中均檢測到LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白，LC3-Ⅱ的數(shù)量與自噬小體的數(shù)量密切相關(guān)，可作為自噬小體形成的良好指標[16-17]，在RA-FLS中LC3-Ⅱ蛋白的相對表達明顯多于OA-FLS，預(yù)示RA-FLS中自噬小體形成增多。自噬體形成后，通過將P62結(jié)合的泛素化底物摻入自噬體中，然后降解為自溶體，P62水平被自噬選擇性降解，并作為自噬通量的讀數(shù)[18]。因此，LC3-Ⅱ水平的增加、P62水平的降低反映了自噬的激活[19]。先前的報道還顯示，RA或關(guān)節(jié)炎患者的FLS自噬增加，F(xiàn)LS自噬途徑持續(xù)活化[20-22]。本研究顯示，RA-FLS中P62 mRNA及蛋白相對表達水平均低于OA-FLS，自噬體形成增加和P62水平降低的組合提示RA中自噬激活;激光共聚焦結(jié)果同樣表明，RA-FLS中LC3蛋白明顯增多，P62蛋白明顯減少，表明RA-FLS中自噬的激活可能是引起其凋亡減少、活性增強的重要因素之一。YANG等[23]也同樣證明了RA-FLS中LC3-Ⅱ的表達上調(diào)以及P62表達的降低，表明RA中巨自噬的激活。

綜上所述，RA-FLS中LC3 mRNA及蛋白的相對表達水平明顯增高，P62 mRNA及蛋白的相對表達水平顯著降低，提示RA中巨自噬水平活化，這可能是導(dǎo)致RA-FLS出現(xiàn)凋亡抵抗，增殖活性明顯高于OA-FLS的潛在原因，從自噬著手治療RA，控制滑膜組織異常增生可能是有效的方案。

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收稿日期：2020-09-14;修回日期：2020-10-30

基金項目：四川省衛(wèi)計委項目基金（18ZD009）

作者單位：1.樂山市人民醫(yī)院，四川 樂山 614000;2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000

通信作者：劉福 四川省南充市順慶區(qū)文化路63號，nslf91@163.com，13890760097