質(zhì)譜技術(shù)在G-四鏈體研究中的進展

譚 江，李亦舟，周 江

(1.重慶大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400030；2.北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

核酸是由核苷酸單體組成的生物大分子，是生物體重要的遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)具有多樣性的特點，除了能夠形成經(jīng)典的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)[1]、RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)[2]外，還可以形成諸如G-四鏈體[3]、i-motif[4]、Z-DNA[5]等非典型的高級結(jié)構(gòu)。G-四鏈體最早由Davies等[3]在對鳥嘌呤核苷酸凝膠結(jié)構(gòu)進行X射線衍射實驗中發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)是富G核酸序列的G堿基之間通過Hoogsteen氫鍵首先形成G-四分體平面，再由2層及以上的G-四分體通過π-π鍵堆疊而成。因G-四鏈體在癌基因的調(diào)控與表達過程的重要作用，引起了研究者們極大的興趣。在人體內(nèi)有許多可能形成G-四鏈體的富含鳥嘌呤的核酸序列，這些富G序列主要存在于端粒、基因啟動子區(qū)及功能基因組等區(qū)域[6-10]。目前，G-四鏈體已經(jīng)成為癌癥等相關(guān)疾病的重要靶標(biāo)，同時還在化學(xué)不對稱催化[11-14]、生物傳感器[15-18]等相關(guān)領(lǐng)域被深入研究。

G-四鏈體結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的研究方法較多，如表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)[19-20]、圓二色光譜(circular dichroism, CD)[21-24]、差示掃描量熱法(DSC)[25-26]、X射線晶體學(xué)(X-ray)[27-29]、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)[30-32]等，但是大多存在核酸樣品用量大、數(shù)據(jù)不直觀、操作復(fù)雜等局限性[38]。而質(zhì)譜因其靈敏度高、準(zhǔn)確度高、樣品量少、分析速度快的特點，已成為研究G-四鏈體及G-四鏈體與小分子配體之間的非共價相互作用不可或缺的工具[33-43]。

1 G-四鏈體形成、結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜研究

1.1 G-四鏈體的形成與結(jié)構(gòu)特征

1993年，Smith等[37]利用電噴霧質(zhì)譜在乙二胺四乙酸和磷酸鈉溶液中觀察到G-四鏈體的存在。后來，Pauw等[33]在H2O-CH3OH-NH4OAc體系條件下進一步開展了G-四鏈體結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜研究，發(fā)現(xiàn)G-四鏈體序列與NH4+的結(jié)合峰可作為判斷G-四鏈體平面層數(shù)的依據(jù)，示于式(1)：

NG-四分體平面層數(shù)-1=N銨離子的個數(shù)

(1)

Yuan等[39]同樣利用電噴霧質(zhì)譜研究了四鏈體 DNA的形成性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)XGGGGX序列(X=T, A, C)會自組裝形成單純的四鏈體，而不是雜鏈四聚體，并且再次通過質(zhì)譜驗證了中心配位的銨離子數(shù)目為 G-四分體平面層數(shù)減1。此外，G-四鏈體自身的序列變化乃至堿基突變對自身的二級結(jié)構(gòu)影響也非常重要。周江等[44]采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和圓二色譜法研究了Kras基因G-四鏈體在部分堿基突變的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，堿基突變使得G-四鏈體的結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化，穩(wěn)定性明顯降低。

1.2 中心陽離子對G-四鏈體形成的影響

G-四鏈體可以由DNA、RNA、LNA和PNA通過靜電引力相互作用形成，但形成G-四分體平面的內(nèi)側(cè)氧負離子會造成靜電排斥作用，一般會導(dǎo)致形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差、多態(tài)性增加。而加入合適的陽離子恰巧能夠中和G-四鏈體腔體內(nèi)的負電荷，提高G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Smith等[37]通過ESI-MS首次觀察到K+、Ca2+、Na+和Li+對d(CGCG4GCG)4G-四鏈體的結(jié)合情況，隨后報道了NH4+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+等陽離子與G-四鏈體結(jié)合的質(zhì)譜研究，且這些結(jié)果在大多數(shù)情況下與通過核磁共振獲得的結(jié)果相近。其中，大多數(shù)陽離子都能起到穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的作用，然而并不是所有陽離子都能夠穩(wěn)定G-四鏈體。研究發(fā)現(xiàn)，陽離子對G-四鏈體的穩(wěn)定能力主要與陽離子的半徑、陽離子與鳥嘌呤O6的結(jié)合強度，以及陽離子水和自由能有關(guān)[45-46]。通常，陽離子對G-四鏈體的穩(wěn)定性表現(xiàn)為Sr2+>Ba2+>K+>Ca2+>Na+、NH4+、Rb+>Mg2+>Li+≥Cs+。陽離子除了能夠穩(wěn)定G-四鏈體外，不同的陽離子還可能誘導(dǎo)G-四鏈體形成不同的結(jié)構(gòu)類型。Lu等[47]通過ESI-MS和CD發(fā)現(xiàn)，PW17 G-四鏈體能夠在同一體系條件下與Pb2+和K+競爭結(jié)合并形成不同構(gòu)型的G-四鏈體。此外，陽離子濃度也可能影響G-四鏈體的結(jié)構(gòu)類型。例如，在Na+低濃度條件下，PW17 G-四鏈體形成反平行結(jié)構(gòu)；而在Na+高濃度條件下，則形成雜合G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

1.3 pH值對G-四鏈體形成的質(zhì)譜研究

G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定除了與陽離子有關(guān)外，還與溶液pH值有關(guān)。Yuan等[48]通過設(shè)置3種不同NH4OH/NH4OAc/AcOH的緩沖溶液，研究了溶液酸堿性對Bcl-2 G-四鏈體[d(G3CGCG3AG2A2G5CG3)]形成及質(zhì)譜檢測的影響。在NH4OAc緩沖溶液條件下，通過ESI-MS檢測到自由纏繞的單鏈DNA以及分子內(nèi)的G-四鏈體基峰，纏繞的DNA單鏈離子峰的相對強度為基峰的70%。在堿性溶液中，G-四鏈體DNA的離子峰仍為基峰，但是自由纏繞的DNA單鏈離子峰的強度有所增加。然而，與中性條件和堿性條件不同之處是，在酸性條件下(pH 4.0)的ESI-MS譜圖中只觀察到G-四鏈體的分子離子峰，但信號強度相對減弱，幾乎看不到自由纏繞的DNA單鏈離子峰的存在。這表明，雖然堿性條件下不利于分子內(nèi)G-四鏈體的形成，但酸性條件也會抑制帶負電荷DNA的質(zhì)譜信號，不利于G-四鏈體的質(zhì)譜檢測。因此，通常選擇接近生理條件pH 7.4的NH4OAc緩沖溶液作為質(zhì)譜研究G-四鏈體的溶液條件。

1.4 與質(zhì)譜兼容的有機溶劑對G-四鏈體形成的影響

在G-四鏈體的質(zhì)譜分析過程中，通常需要向樣品溶液中添加一定比例的揮發(fā)性有機溶劑以發(fā)揮去溶劑化作用，并提高G-四鏈體檢測的信噪比。目前已報道的用于G-四鏈體ESI-MS分析的常用有機溶劑有甲醇[49-52]、異丙醇[53-54]、乙腈[55]等，但有機溶劑對提升G-四鏈體的檢測能力各不相同。通常情況下，有機溶劑的去水合作用越強，其誘導(dǎo)能力越顯著，越有利于G-四鏈體的檢測。Gabelica等[56]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與ESI-MS兼容的有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈)加入到含有端粒DNA序列(d(TAGGGTTAGGGT))的NH4OAc水溶液中，除了會增加二聚體G-四鏈體的形成速率和穩(wěn)定性，還能夠使其從反平行結(jié)構(gòu)向平行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。另外，Yuan等[57]在對miR-1587 G-四鏈體的研究過程中發(fā)現(xiàn)，常見的3種有機溶劑去水合作用及分子擁擠效應(yīng)的順序為：甲醇>乙醇>乙腈。而在這3種高濃度有機溶劑條件下，并不能促使miR-1587形成單鏈的G-四鏈體，而是促使miR-1587形成二聚G-四鏈體，并且分子擁擠試劑的去水合作用越強，其誘導(dǎo)能力越顯著。此外，該課題組還發(fā)現(xiàn)，提高有機溶劑的比例雖然有利于miR-1587形成G-四鏈體，但是過高的G-四鏈體濃度會影響G-四鏈體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和解離。因此，合適濃度的有機溶劑和富G核酸序列對G-四鏈體的質(zhì)譜檢測非常重要。

1.5 類生理條件下G-四鏈體的研究

G-四鏈體作為非典型的核酸二級結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出重要的結(jié)構(gòu)多態(tài)性，不同的結(jié)構(gòu)可能與其功能密切相關(guān)。因此，研究生理和病理條件下G-四鏈體的真實結(jié)構(gòu)，對于了解相關(guān)致病機理及以G-四鏈體為靶標(biāo)的前藥篩選極為重要。但是，生理條件下的G-四鏈體處在高濃度的KCl和NaCl中，而要通過質(zhì)譜實現(xiàn)類生理條件下G-四鏈體結(jié)構(gòu)與性質(zhì)以及小分子配體的篩選研究，首先要克服KCl、NaCl對G-四鏈體的檢測和數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響。目前，通常采用離子半徑與K+接近的揮發(fā)性NH4+(NH4OAc)模擬高濃度KCl、NaCl條件，然而NH4OAc中的G-四鏈體比KCl溶液中G-四鏈體的穩(wěn)定性更差、多態(tài)性更強。同時，NH4+還易與磷酸基團進行特異性結(jié)合，導(dǎo)致譜圖復(fù)雜性增加，與生理狀態(tài)下G-四鏈體的真實結(jié)構(gòu)存在較大差異[58]。因此，該條件不能真實反映G-四鏈體在細胞環(huán)境內(nèi)的真實構(gòu)型。對此，Gabelica等[58]開發(fā)了與ESI-MS 兼容的TMAA+KCl緩沖體系，用于ESI-MS研究G-四鏈體在生理條件下的拓撲結(jié)構(gòu)，與等效的NH4OAc相比，TMAA+KCl混合物通過抑制G-四鏈體外部的非特異性加合物從而降低譜圖復(fù)雜性，有利于形成與生理狀態(tài)下高濃度KCl和NaCl(生理相關(guān)陽離子)類似的拓撲結(jié)構(gòu)。此后，Richter等[59]檢測了TEA/HFIP+IPA+KCl體系下K+與G-四鏈體的結(jié)合狀態(tài)，相比于TMAA/KCl體系，能夠在不影響生理折疊的情況下提高對G-四鏈體的檢測靈敏度及有序性(相比于NH4OAc，KCl的多電荷峰消失)，實現(xiàn)對亞微摩爾級別G-四鏈體和小分子配體復(fù)合物的分析。最近，Bartlett等[60]采用九氟叔正丁醇(NFTB)和辛胺(OA)體系進行了G-四鏈體的質(zhì)譜研究，相比于含六氟異丙醇(HFIP)和三乙胺(TEA)的傳統(tǒng)流動相組合，能夠進一步降低NH4OAc-CH3OH-H2O條件下G-四鏈體的質(zhì)譜圖復(fù)雜性，提高對G-四鏈體的靈敏度，有望用于KCl條件下G-四鏈體拓撲構(gòu)型的研究。

1.6 G-四鏈體的碰撞-解離行為

研究G-四鏈體在質(zhì)譜條件下的碰撞解離行為，可以進一步了解其在氣相條件下與配體以及陽離子的結(jié)合比例及穩(wěn)定性。2002年，Thomas等[61]首次通過質(zhì)譜CAD碎裂模式研究G-四鏈體及其小分子配體的結(jié)合。此后，Mazzitelli等[62]發(fā)現(xiàn)，具有不同鏈數(shù)量和不同結(jié)構(gòu)的G-四鏈體在CAD碰撞模式下會產(chǎn)生不同的斷裂途徑。在一定的能量碰撞情況下，四條鏈組成的G-四鏈體會被解離成三鏈和單鏈，相應(yīng)核酸序列的堿基也會存在不同程度掉落的情況，而雙鏈組成的G-四鏈體主要通過前體離子的鳥嘌呤堿基丟失而僅存在部分解離。此外，在三條鏈組成的G-四鏈體CAD譜圖中觀察到更低的單鏈分離比例。這表明，四鏈體的不同序列或方向可能會影響G-四鏈體的碎裂途徑。

Yuan等[63]發(fā)現(xiàn)，3種對Bcl-2 mRNA G-四鏈體具有高結(jié)合親和力的天然生物堿(兩面針堿、黃藤素和麻黃堿)會導(dǎo)致G-四鏈體不同碰撞解離現(xiàn)象。在低能量狀態(tài)下，G-四鏈體及其配合物在較低的碰撞能量下均丟失NH4+。當(dāng)碰撞能量增加時，復(fù)合物中堿基的丟失比小分子丟失更容易，這表明，生物堿分子與mRNA G-四鏈體之間的非共價結(jié)合作用較強，并不是依靠簡單的靜電吸附發(fā)生結(jié)合。近期，Lee等[64]觀察到Na+一種有趣的碰撞誘導(dǎo)解離行為，其特征是在低能量狀態(tài)下優(yōu)先同時丟失2個G配體，在碰撞激活Na+結(jié)合的G-四分體時，可以輕松產(chǎn)生中性氫鍵二聚體，再次豐富了對G-四鏈體結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的認知。

2 RNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜研究

RNA G-四鏈體是細胞內(nèi)主要的非常規(guī)RNA二級結(jié)構(gòu)，具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)作用，受到研究者們的重視[65-72]。Kim等[73]最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)長度為19個堿基的RNA片段能夠形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，隨后又陸續(xù)報道了在mRNA、長鏈非編碼RNA和端粒末端中存在RNA G-四鏈體。與DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)不同的是，RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，主要存在于細胞質(zhì)中，不存在像DNA一樣的雙鏈競爭平衡，能夠穩(wěn)定存在于細胞結(jié)構(gòu)中，可以更直接地參與很多生理過程。因此，探索RNA的高級結(jié)構(gòu)對解釋諸多關(guān)鍵生物學(xué)過程尤為重要。

在常規(guī)條件下，DNA一般可形成3種不同的G-四鏈體構(gòu)型，但是RNA由于呋喃糖環(huán)上2’-羥基的存在限定了糖苷鍵的取向，增加了RNA G-四鏈體與水分子以及分子內(nèi)作用力，使RNA G-四鏈體通常只能形成熱穩(wěn)定性更高的正平行結(jié)構(gòu)[74-77]。因此，在電噴霧質(zhì)譜實驗中，RNA G-四鏈體通常表現(xiàn)為較低加和電荷的現(xiàn)象，一般為2～4電荷，而長鏈序列電荷一般為5～11。通常，RNA G-四鏈體能夠被小分子穩(wěn)定并調(diào)控，從而達到抑制致病基因表達的目的。Richter等[78]通過質(zhì)譜、CD等儀器手段研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1核衣殼蛋白NCp7能夠結(jié)合并展開HIV-1 RNA G-四鏈體促進DNA/RNA雙鏈體形成，從而允許逆轉(zhuǎn)錄進行。但小分子配體的加入?yún)s阻礙逆轉(zhuǎn)錄過程在逆轉(zhuǎn)錄酶和NCp7的作用，這種新的機制將為研制抗HIV-1藥物提供一定的幫助。另外，RNA容易發(fā)生二聚現(xiàn)象。Yuan等[57]在對miR-1587與小分子配體的質(zhì)譜研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1587可以在較高濃度NH4+和分子擁擠環(huán)境的誘導(dǎo)下形成上下堆疊的二聚G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并能夠與2種藥根堿衍生物按照1∶2的比例結(jié)合，但藥根堿本身不能夠誘導(dǎo)miR-1587形成G-四鏈體二聚結(jié)構(gòu)。此外還發(fā)現(xiàn)[79]，與miR-1587具有相同序列的DNA-1587和dU-DNA-1587均不能形成二聚G-四鏈體結(jié)構(gòu)，說明RNA G-四鏈體發(fā)生二聚可能會受到陽離子、核苷酸、小分子配體等多種因素的影響。Li等[80]利用電噴霧電離質(zhì)譜與圓二色光譜發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌相關(guān)的miR-92a啟動子區(qū)域的富含G序列能夠在KCl或NH4OAc溶液中形成平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。在高濃度NH4OAc情況下，ESI-MS顯示具有4個銨離子的二聚G-四鏈體結(jié)構(gòu)的峰。

此外，通常需要使用退火處理以解開RNA的其他二級結(jié)構(gòu)，從而使RNA G-四鏈體的結(jié)構(gòu)更偏向于單一結(jié)構(gòu)，但也存在少數(shù)情況[81-83]。例如，Xu等[84]借助NMR、CD和ESI-MS等儀器，發(fā)現(xiàn)含有8-溴鳥苷修飾的人類端粒RNA 序列形成反平行結(jié)構(gòu)的RNA G-四鏈體。這些研究增加了我們對于RNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)性質(zhì)更深層次的了解。

3 G-四鏈體配體分子的質(zhì)譜篩選

篩選高親和力和選擇性結(jié)合誘導(dǎo)G-四鏈體形成并穩(wěn)定G-四鏈體的配體小分子對于相關(guān)疾病的治療具有重要的意義，目前已有文獻報道通過G-四鏈體小分子配體調(diào)控癌癥基因的表達[85-86]。質(zhì)譜在非共價相互作用的檢測方面具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度，并可獲得化學(xué)計量比等優(yōu)勢，因此廣泛應(yīng)用于G-四鏈體的小分子識別研究。根據(jù)G-四鏈體的特征來看，G-四鏈體與小分子可能的結(jié)合位點包括：G-四鏈體平面、G-四鏈體中心通道、側(cè)鏈堿基、磷酸骨架及其臨近溝區(qū)等[87]。因此，將G-四鏈體配體分子按照其結(jié)構(gòu)特征以及作用力類型的方式分為3類[88-89]：1) 平面堆疊結(jié)合的分子；2) 溝區(qū)結(jié)合分子；3) 側(cè)鏈結(jié)合分子。

3.1 配體分子結(jié)合親和力的質(zhì)譜算法

配體對G-四鏈體的親和力和選擇性可以根據(jù)質(zhì)譜中G-四鏈體及其結(jié)合離子峰強度的特定參數(shù)進行評估。為了評價小分子配體與G-四鏈體的結(jié)合能力，常使用參數(shù)IRa值定義小分子配體與G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合能力的強弱[33,48]，示于式(2)：

IRa=ΣIr[G+nP]m-/

ΣIr[G+nP]m-+ΣIr[G]m-

(2)

其中，m為電荷數(shù)，n為結(jié)合小分子的個數(shù)。分子部分表示G-四鏈體與小分子配體復(fù)合物所有譜峰的相對強度之和，分母部分表示所有包含G-四鏈體峰的相對強度之和。因此，IRa值表示所有結(jié)合占總G-四鏈體的比例，該值越大，表示G-四鏈體-小分子配體復(fù)合物的比例越高，即G-四鏈體與小分子配體的親和力越強。根據(jù)這一評價算法，后續(xù)就可以利用質(zhì)譜對配體小分子的結(jié)合親和力進行評價。

3.2 高親和力配體分子的質(zhì)譜篩選

目前已報道的G-四鏈體配體分子大多屬于平面堆疊結(jié)合小分子，其母核包括喹啉、吖啶、蒽醌等芳香基團，主要以π-π鍵與G-四鏈體的G-四分體平面相互作用。Yuan等[38]利用電噴霧質(zhì)譜法研究了端粒G-四鏈體、雙鏈DNA與二萘嵌苯類衍生物(Tel03)、PyPyPyγImImImβDp、ImImImβDp等小分子之間的相互作用，首次在同一體系中檢測到小分子對雙鏈、G-四鏈體DNA特異性的識別，發(fā)現(xiàn)Tel03分子與端粒G-四鏈體的結(jié)合最強，且有特異的選擇性識別。質(zhì)譜圖中同時顯示出多種核酸結(jié)構(gòu)及相應(yīng)結(jié)合物的峰，凸顯了質(zhì)譜的化學(xué)專一性。Yuan等[48]還利用前述IRa質(zhì)譜算法研究了7種小分子與bcl-2序列四鏈體之間的親和性強弱順序, 并找出了2個能夠引起四鏈體與雙鏈 DNA轉(zhuǎn)化的小分子。

3.3 高選擇性配體分子的質(zhì)譜篩選

在平面結(jié)合的分子基礎(chǔ)上，加入能夠增強配體分子結(jié)合力、選擇性和親水性的正電荷或易于質(zhì)子化的氨基團等親水基團，可以增強溝區(qū)或側(cè)鏈區(qū)的靜電力、氫鍵或范德華力。例如，Neidle等利用質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，TMPy4[90]、BSU6039[91]、四取代萘酰亞胺分子能夠與d(TAGGGTTAGGG)2G-四鏈體的平面進行堆疊以及與側(cè)鏈結(jié)合。當(dāng)配體小分子的共軛平面大于雙鏈中互補堿基對的平面時，會增加小分子配體與G-四分體的π-π堆疊作用，使G-四鏈體的穩(wěn)定性增加，同時實現(xiàn)對G-四鏈體的選擇性識別。Carla等[92]利用ESI-MS與XRD對人類端粒DNA G-四鏈體與具有平面結(jié)構(gòu)、帶有正電荷以及具有芳香基團的[Au(9-methylcaffein-8-ylidene)2]+形成的復(fù)合物進行表征，發(fā)現(xiàn)[Au(9-methylcaffein-8-ylidene)2]+能夠在雙螺旋DNA存在下選擇性地結(jié)合DNA G-四鏈體結(jié)構(gòu)。Alessandro等[93]通過ESI-MS對3種不同的G-四鏈體結(jié)構(gòu)(人類端粒重復(fù)序列的寡核苷酸HTelo21、2種人類致癌基因啟動子c-myc、c-kit)、雙鏈DNA(DK66)與苯并吡喃類生物堿塔斯品堿及其合成類似物的非共價相互作用進行研究，發(fā)現(xiàn)塔斯品堿對人類端粒重復(fù)序列HTelo21和雙鏈寡核苷酸DK66具有不同化學(xué)計量比的結(jié)合。這一研究展示了質(zhì)譜技術(shù)在化學(xué)計量比確定方面直觀、準(zhǔn)確的特性。

Yuan等[94]在具有旋光異構(gòu)的分子對N-myc G-四鏈體識別的質(zhì)譜研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DNA樣品與粉防己堿配體分子的濃度比為1∶4時，可以觀察到N-myc G-四鏈體結(jié)合1個和2個粉防己堿分子的G-四鏈體復(fù)合物峰，最終結(jié)合2個配體分子的復(fù)合物峰為基峰，幾乎無法觀測到不結(jié)合小配體分子的G-四鏈體峰。在相同的實驗條件下，異粉防己堿與N-myc G-四鏈體結(jié)合峰的相對強度較弱，在50%以下，不結(jié)合配體分子的N-myc G-四鏈體為基峰。實驗結(jié)果表明，配體小分子的旋光異構(gòu)性對其與G-四鏈體的結(jié)合有著重要影響。

當(dāng)配體分子骨架具有一定柔性，其分子結(jié)構(gòu)與G-四鏈體不規(guī)則溝區(qū)相匹配時，也會增大結(jié)合選擇性。例如，Li等[95]在利用質(zhì)譜對c-myc G-四鏈體的研究中發(fā)現(xiàn)，雙芐基異喹啉類生物堿——粉防己堿和防己諾林堿能夠選擇性地與c-myc G-四鏈體的單堿基螺旋槳側(cè)鏈形成中等尺寸的溝區(qū)進行結(jié)合，同時具有顯著的G-四鏈體/雙鏈DNA選擇性和平行鏈/雜交鏈G-四鏈體選擇性。此外，粉防己堿還能夠誘導(dǎo)端粒G-四鏈體序列發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變。另有報道發(fā)現(xiàn)，偏端霉素A也能夠與d(TGGGGT)4 G-四鏈體的溝區(qū)進行結(jié)合[96]，而芳香族化合物diamidine DB832與特殊的G-四鏈體結(jié)合時[97]，會有2個小分子堆疊在G-四鏈體平面上，此外還會有3～4個分子結(jié)合在該G-四鏈體的溝區(qū)。Yuan等設(shè)計了1個環(huán)狀分子cβ，利用質(zhì)譜驗證其可以高選擇性地識別c-myb原癌基因G-四鏈體[98]。理論計算顯示，cβ環(huán)狀分子是在大溝區(qū)與c-myb 四鏈體側(cè)鏈部分以氫鍵相互作用。

4 其他用于G-四鏈體構(gòu)象分析的質(zhì)譜技術(shù)

常規(guī)的質(zhì)譜技術(shù)很難確定G-四鏈體的構(gòu)型，將傳統(tǒng)質(zhì)譜與其他技術(shù)聯(lián)用將有助于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的解析，包括H/D交換質(zhì)譜法(HDX-MS)、紅外多光子解離質(zhì)譜法(IRMPD-MS)、離子淌度質(zhì)譜法(IM-MS)等。

4.1 H/D交換質(zhì)譜

盡管氫-氘交換質(zhì)譜已被廣泛用于分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)[99]，但該技術(shù)用于G-四鏈體結(jié)構(gòu)與性質(zhì)分析的報道較少。理論上，寡核苷酸上的H/D交換可能包含以下幾個交換位點：核糖的5’-和3’-羥基末端、核糖的2’-羥基末端、磷酸基團、以及堿基的氨基和亞氨基。因此，H/D交換可用于G-四鏈體的結(jié)構(gòu)分析。研究表明[100]，DNA G-四鏈體在三甲基乙酸銨溶液和ESI源的條件下，磷酸基團完全H/D交換，而交換的堿基會保持標(biāo)記狀態(tài)，不會進行反向交換。H/D交換率不取決于它們的電荷狀態(tài)和非特異性加合物的存在，而是在很大程度上取決于寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)(氫鍵狀態(tài))。此前，Vairamani和Gross[101]報道了凝血酶結(jié)合適體GGTTGGTGTGGTTGG的H/D交換，在氣相H/D交換條件下，與不帶陽離子的適配體相比，帶有K+或Sr2+結(jié)合的適配體具有更緊湊的結(jié)構(gòu)。Gabelica等[102]研究發(fā)現(xiàn)，四鏈體[(TGGGGT)4·3NH4+]與相應(yīng)的單鏈TGGGGT，DNA雙鏈體和其他測試的四鏈體相比，在正離子和負離子模式下能實現(xiàn)較快的H/D交換。此外還發(fā)現(xiàn)，G-四鏈體的H/D交換主要取決于基本位點對氘化溶劑的可及性。與液相條件下不同的是，氣相狀態(tài)下結(jié)構(gòu)越緊湊的G-四鏈體更容易發(fā)生快速的H/D交換。

4.2 紅外多光子解離質(zhì)譜

4.3 離子淌度質(zhì)譜

離子淌度質(zhì)譜是基于離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞時的碰撞截面不同，將離子按大小和形狀進行分離，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、多肽、核酸及復(fù)雜化合物異構(gòu)體分析的重要工具，因此可以用來對G-四鏈體結(jié)構(gòu)進行構(gòu)象分析。2005年，Bowers等[104]首次利用離子淌度質(zhì)譜進行了G-四鏈體的結(jié)構(gòu)研究，并成功得到了4種不同G-四鏈體的碰撞橫截面積(CCS)，而平行結(jié)構(gòu)和反平行結(jié)構(gòu)具有不同的碰撞橫截面積。Gabelica 等[105]發(fā)現(xiàn)，G-四鏈體碰撞橫截面積與末端堆積和嵌入模型明顯一致，末端堆積是具有G-四鏈體結(jié)構(gòu)與配體分子的首選結(jié)合模式。周江等[106]利用離子淌度質(zhì)譜驗證了c-myc序列退火后構(gòu)象從單體四鏈體轉(zhuǎn)化形成二聚四鏈體。最近，Gabelica等[107]比較了TMAA/KCl體系中端粒RNA和DNA G-四鏈體，并對離子淌度質(zhì)譜是否有助于分析G-四聯(lián)體拓撲結(jié)構(gòu)進行了評估，發(fā)現(xiàn)氣相高電荷狀態(tài)下的G-四鏈體結(jié)構(gòu)更接近溶液狀態(tài)下G-四鏈體的真實結(jié)構(gòu)。但是在液相條件下的低電荷G-四鏈體在氣相條件下的結(jié)構(gòu)將進一步緊縮，與真實狀態(tài)下的G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有差異。

5 展望

在過去的20多年，已經(jīng)對G-四鏈體有了較為廣泛深入的研究，表明G-四鏈體結(jié)構(gòu)在調(diào)控許多疾病基因的表達過程中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)前的質(zhì)譜技術(shù)在表征核酸高級結(jié)構(gòu)方面具有快捷、靈敏、直觀，以及能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)計量比等檢測優(yōu)勢。但是，G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有動態(tài)多樣性，容易受到多種因素的影響，質(zhì)譜能夠提供的構(gòu)象信息有限，因此在G-四鏈體的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究中，常聯(lián)合搭配使用NMR、CD、SPR等技術(shù)對質(zhì)譜結(jié)果進行驗證，從而獲得更加全面的結(jié)構(gòu)信息。今后，隨著解析G-四鏈體多樣性結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜技術(shù)與算法的突破，以及用于區(qū)別不同構(gòu)型、不同核苷酸類型的G-四鏈體探針的開發(fā)，將會為G-四鏈體的質(zhì)譜研究帶來更大的突破。