Ki-67增殖指數(shù)在初治可切除胃癌預(yù)后中的價(jià)值

廖承磊，劉立恒，王子衛(wèi)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科 400010)

胃癌是世界上五大惡性腫瘤之一，并且是第三大癌癥致死原因[1]。在我國也是最常見的惡性腫瘤之一。由于人口老齡化及傳統(tǒng)生活方式改變等原因，未來胃癌發(fā)病率將顯著上升[2]。雖然手術(shù)切除仍然是初治可切除胃癌最有效的治療方式，但近一半的患者在手術(shù)切除后復(fù)發(fā)并發(fā)展成為晚期胃癌[3]，致使患者的5年總體生存率相對較低[4]。目前TNM分期系統(tǒng)仍然是評估胃癌患者預(yù)后最重要的工具，但是在初治可切除胃癌患者當(dāng)中，即使是相同TNM分期的患者，接受了根治性切除手術(shù)后，也會(huì)表現(xiàn)出不同的臨床結(jié)局。因此，急需尋找新的工具去預(yù)測初治可切除胃癌的生存。

Ki-67是一種核DNA結(jié)合蛋白，存在于細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期，而在靜止的G0期細(xì)胞中不表達(dá)。近年來，Ki-67增殖指數(shù)被廣泛用于評估腫瘤細(xì)胞的增殖能力。除此之外，Ki-67增殖指數(shù)與多種腫瘤的無病生存期(DFS)及總體生存期(OS)呈顯著負(fù)相關(guān)。在乳腺癌中，Ki-67增殖指數(shù)是影響DFS及OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5-6]。同樣，1項(xiàng)回顧性研究表明，早期胃癌中，Ki-67高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)[7]。然而，Ki-67對預(yù)后的判斷作用仍有爭議，有學(xué)者認(rèn)為Ki-67增殖指數(shù)并不能預(yù)測胃癌患者的臨床結(jié)局[8]；有的甚至認(rèn)為，低Ki-67表達(dá)水平患者，預(yù)后反而更差[9]。本研究旨在評估Ki-67增殖指數(shù)在胃癌預(yù)后中的預(yù)測價(jià)值，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療及患者分層。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年12月至2014年11月就診于本院胃腸外科并確診為胃癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡18～80歲。(2)經(jīng)手術(shù)根治術(shù)后病理檢測結(jié)果為腺癌。(3)患者病例資料齊全，包括：年齡、性別、聯(lián)系方式、手術(shù)方式、術(shù)后病理資料，其中病理資料需包括Ki-67增殖指數(shù)。(4)患者術(shù)后均進(jìn)行輔助化療，化療方案以氟尿嘧啶衍生物替吉奧為基礎(chǔ)，連續(xù)口服給藥14 d，休息7 d，或聯(lián)合靜脈給藥奧沙利鉑、多西他賽、伊立替康；或者以奧沙利鉑為基礎(chǔ)第1天靜脈化療，聯(lián)合伊立替康或多西他賽；藥物劑量均以體表面積計(jì)算。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前新輔助放化療者；(2)術(shù)前已經(jīng)發(fā)生影像學(xué)能證實(shí)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不能行根治性切除者，包括肝、肺、卵巢等；(3)大量腹水或惡病質(zhì)的患者；(4)嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肝臟、腎臟疾病，精神病，糖尿病患者；(5)病理類型混合有神經(jīng)內(nèi)分泌癌及其他病理類型者。共納入90例患者，對所有患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間將手術(shù)時(shí)間作為起始時(shí)間，截止時(shí)間為2019年11月30日，根據(jù)美國抗癌協(xié)會(huì)和國際抗癌聯(lián)盟(AJCC/UICC)第8版TNM分期進(jìn)行分期，預(yù)后評價(jià)指標(biāo)為患者5年總體生存率。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

鼠抗人Ki-67、人類表皮生長因子受體2(Her-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)單克隆抗體，免疫組織化學(xué)Max Vision 試劑盒和二氨基苯聯(lián)胺(DAB)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)

標(biāo)本經(jīng) 10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚度切片，脫蠟水化后，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 min×3次；高溫高壓組織抗原修復(fù)(檸檬酸鹽緩沖液95 ℃ 浸泡反應(yīng)10 min)，PBS漂洗3 min×3次；滴加一抗(以PBS取代一抗作陰性對照)，4 ℃冰箱過夜，取出PBS漂洗3 min×3次；滴加多聚酶標(biāo)二抗室溫孵育15 min,PBS漂洗3 min×3次；DAB顯色3 min；流水清洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片,光鏡觀察結(jié)果，由重慶醫(yī)科大學(xué)病理中心進(jìn)行分析，以已知的Ki-67、Her-2、VEGF、VEGFR陽性的胃癌切片作陽性對照。

1.2.3結(jié)果判定

每張切片選擇 10 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算平均陽性細(xì)胞比例為該腫瘤的陽性細(xì)胞百分比。Ki-67在細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)為棕黃色顆粒為顯色，Her-2、VEGF、VEGFR以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色，染色腫瘤細(xì)胞大于或等于10%為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對患者臨床病理特征分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位間距[M(P25,P75)]表示，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行Ki-67增殖指數(shù)及臨床病理參數(shù)比較。Kaplan-Meier生存分析及Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素及多因素分析研究各臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系，log-rank檢驗(yàn)曲線間差異。采用logistic回歸進(jìn)行單獨(dú)病理分期、Ki-67聯(lián)合病理分期及Ki-67聯(lián)合病理分期及分化程度的生存分析并獲得其預(yù)測概率。利用概率值制作受試者工作特征(ROC)曲線評價(jià)病理分期、Ki-67聯(lián)合病理分期，以及Ki-67聯(lián)合病理分期及分化程度對預(yù)后的判斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

90例患者中，男76例(84.44%)，女14例(15.56%)。45例(50.00%)患者年齡大于或等于60歲，45例(50.00%)患者年齡小于60歲。63例(70.00%)患者為低分化，22例(24.44%)患者為中高分化，5例(5.56%)患者病理檢測結(jié)果未報(bào)告分化程度。30例(33.33%)患者為T1/T2期，60例(66.67%)患者為T3/T4期。35例(38.89%)患者未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，55例(61.11%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。21例(23.33%)患者Ⅰ期，69例(76.67%)患者Ⅱ/Ⅲ期。Her-2陽性52例(57.78%)，Her-2陰性37例(41.11%)，1例(1.11%)患者病理未報(bào)告Her-2表達(dá)情況。41例(45.56%)患者VEGF/VEGFR表達(dá)陽性，39例(43.33%)患者VEGF/VEGFR表達(dá)陰性，10例(11.11%)患者未報(bào)告VEGF/VEGFR表達(dá)情況，見表1。Ki-67、Her-2、VEGF、VEGFR染色見圖1。

表1 Ki-67增殖指數(shù)與臨床病理特征的相關(guān)性比較(n=90)

續(xù)表1 Ki-67增殖指數(shù)與臨床病理特征的相關(guān)性比較(n=90)

2.2 Ki-67增殖指數(shù)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，Ki-67增殖指數(shù)與患者性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、Her-2表達(dá)狀態(tài)、VEGF/VEGFR表達(dá)狀態(tài)無關(guān)(P>0.05)。但是，年齡大于或等于60歲患者的Ki-67增殖指數(shù)明顯高于年齡小于60歲患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.156,P=0.031)，且低分化胃癌患者Ki-67增殖指數(shù)明顯低于中高分化胃癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.634,P=0.008)，見表1。

2.3 各臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的Kaplan Meier分析

為了進(jìn)一步研究Ki-67增殖指數(shù)及臨床病理因素與患者預(yù)后的關(guān)系，筆者進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示，患者的性別、年齡與5年總體生存率無關(guān)(P>0.05)。而低分化、T3/T4分期、N+期、病理分期Ⅱ/Ⅲ期患者的5年總體生存率明顯低于中高分化、T1/T2分期、N0期、病理分期Ⅰ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012、0.013、0.008、0.006)，見表2。值得注意的是，Ki-67增殖指數(shù)小于30%的患者5年總體生存率明顯低于Ki-67增殖指數(shù)大于或等于30%的患者，5年總體生存率分別為35.29%、71.23%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。生存曲線見圖2。

A：Ki-67 HE染色(50×)；B：Ki-67免疫組織化學(xué)陽性(100×)；C：Ki-67免疫組織化學(xué)陽性(400×)；D：Her-2 HE染色(50×)；E：Her-2免疫組織化學(xué)陽性(100×)；F：Her-2免疫組織化學(xué)陽性(400×)；G：VEGF HE染色(50×)；H：VEGF免疫組織化學(xué)陽性(100×)；I：VEGF免疫組織化學(xué)陽性(400×)；J：VEGFR HE染色(50×)；K：VEGFR免疫組織化學(xué)陽性(100×)；L：VEGFR免疫組織化學(xué)陽性(400×)。

表2 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的Kaplan Meier分析

續(xù)表2 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的Kaplan Meier分析

A：分化程度;B:T分期;C:N分期;D:病理分期;E:Ki-67增殖指數(shù)。

2.4 各臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的單因素Cox回歸分析

為了驗(yàn)證Ki-67增殖指數(shù)及各臨床病理因素與患者預(yù)后的關(guān)系，筆者進(jìn)行了單因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示，分化程度、T分期、N分期、病理分期及Ki-67增殖指數(shù)是胃癌患者5年總體生存率的影響因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=4.073,P=0.021;HR=3.135,P=0.019;HR=2.940,P=0.011;HR=5.833,P=0.016;HR=2.885,P=0.005)，性別、年齡、Her-2表達(dá)狀態(tài)、VEGF/VEGFR表達(dá)狀態(tài)與患者5年總體生存率無明顯相關(guān)性(P=0.428、0.716、0.171、0.285)。見表3。

表3 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的單因素Cox回歸分析

續(xù)表3 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的單因素Cox回歸分析

2.5 各臨床病理參數(shù)與預(yù)后的多因素的Cox回歸分析

將上述指標(biāo)進(jìn)一步納入多因素Cox回歸分析，平衡分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響后，結(jié)果表明，病理分期及Ki-67增殖指數(shù)是患者5年總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=5.114,P=0.026;HR=2.746,P=0.010),見表4。

表4 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的多因素Cox回歸分析

續(xù)表4 臨床病理參數(shù)與5年總體生存率的多因素Cox回歸分析

2.6 ROC曲線分析3種模型對患者生存的預(yù)測能力

為了提高AJCC/UICC第8版TNM分期在判斷胃癌患者生存率的能力，筆者以Ki-67增殖指數(shù)30%為臨界點(diǎn)將胃癌患者分成高低兩組，并按病理分期分為Ⅰ期及Ⅱ/Ⅲ期兩組，按分化程度分為低分化及中高分化兩組，利用二元logistic回歸計(jì)算病理分期模型及Ki-67增殖指數(shù)聯(lián)合病理分期模型、Ki-67增殖指數(shù)聯(lián)合病理分期及分化程度模型預(yù)測患者的生存能力，并利用預(yù)測概率制作3種情況下的ROC曲線，并計(jì)算ROC曲線下面積(area under curve，AUC)。結(jié)果顯示，病理分期模型的AUC為0.636(P=0.032)，靈敏度和特異度分別為0.939、0.667，臨界值為0.272 2；Ki-67增殖指數(shù)聯(lián)合病理分期模型的AUC為0.716(P=0.001)，靈敏度和特異度分別為0.970、0.719，臨界值為0.155 7；而Ki-67增殖指數(shù)聯(lián)合病理分期及分化程度模型的AUC為0.778(P<0.001)，靈敏度和特異度分別為0.967、0.709，臨界值為0.119 8。可見，Ki-67聯(lián)合病理分期及分化程度模型明顯優(yōu)于其他兩種模型的預(yù)測能力。見圖3。

A：病理分期模型的ROC曲線；B：Ki-67聯(lián)合病理分期模型的ROC曲線；C：Ki-67聯(lián)合病理分期及分化程度模型的ROC曲線。

3 討 論

Ki-67作為一種核DNA結(jié)合蛋白，參與了有絲分裂時(shí)期染色體外表面蛋白外殼的形成，在染色體表面作為一種表面激活劑促進(jìn)有絲分裂的進(jìn)行[10]，似乎Ki-67高的腫瘤細(xì)胞具有更差的表型及更強(qiáng)的侵襲性，而本研究得出低Ki-67增殖指數(shù)的胃癌細(xì)胞傾向于低分化，可能與Ki-67抑制細(xì)胞分裂期間染色體的聚集有關(guān)[11-12]，低Ki-67增殖指數(shù)對于染色體聚集的抑制作用弱。而異染色體的形成與SMAD4基因表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系[13]。SMAD4是一種抑癌基因，它在多種腫瘤中表現(xiàn)出表達(dá)缺失，包括胃腺癌[14]。低Ki-67增殖指數(shù)促進(jìn)異染色質(zhì)的形成，下調(diào)了SMAD4基因的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，使得胃癌細(xì)胞向低分化發(fā)展，進(jìn)而縮短患者的生存時(shí)間。同時(shí)，端粒是一種特殊的異染色體結(jié)構(gòu)，研究顯示[15]，中高分化的胃癌細(xì)胞端粒長度明顯長于低分化的胃癌細(xì)胞，并且，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞端粒長度明顯短于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞，提示端?？s短會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的進(jìn)展，這進(jìn)一步提示低Ki-67的胃癌細(xì)胞不能阻止端?？s短，致使胃癌細(xì)胞低分化。綜上所述，低Ki-67增殖指數(shù)的胃癌細(xì)胞向低分化發(fā)展，導(dǎo)致患者預(yù)后更差。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多與胃癌增殖、分化、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物，如EGRF、VEGF、Her-2、Ki-67。本研究表明，Ki-67增殖指數(shù)與VEGF/VEGFR、Her-2的表達(dá)并不存在相關(guān)性，VEGF/VEGFR、Her-2的陽性表達(dá)也與胃癌患者預(yù)后無關(guān)。Ki-67增殖指數(shù)被報(bào)道與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)，比如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌，大多數(shù)傾向于高Ki-67增殖指數(shù)的患者預(yù)后更差[6，16]。筆者以30%為截?cái)嘀祵⑽赴┗颊哌M(jìn)行分組，結(jié)果顯示，低Ki-67增殖指數(shù)的患者的預(yù)后明顯更差，Ki-67增殖指數(shù)小于30%及大于或等于30%的患者5年總體生存率分別為35.29%、71.23%，兩組生存曲線有明顯差異(P=0.003)。這也是國內(nèi)率先報(bào)道高Ki-67增殖指數(shù)的胃癌患者5年總體生存率更長。低Ki-67增殖指數(shù)患者的5年總體生存率更短，反映了在非轉(zhuǎn)移胃癌患者當(dāng)中，低Ki-67表達(dá)的癌細(xì)胞具有低增殖能力及高侵襲性的特點(diǎn)。

大量研究表明，增殖能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞對化療敏感性好。1項(xiàng)前瞻性研究表明[17]，Ki-67增殖指數(shù)大于35%的乳腺癌新輔助化療患者的化療反應(yīng)性更好，在病理完全緩解組的Ki-67增殖指數(shù)平均水平顯著高于未獲得病理完全緩解組。1項(xiàng)meta分析[18]顯示，在接受新輔助化療的乳腺癌患者中，高表達(dá)Ki-67組比低表達(dá)Ki-67組有更高的病理完全緩解率。因此，本研究中，低Ki-67增殖指數(shù)組患者5年總體生存率低可能與胃癌細(xì)胞低增值率對化療不敏感有關(guān)。所以，Ki-67增殖指數(shù)預(yù)測胃癌患者新輔助或輔助化療效果可能具有相當(dāng)大的價(jià)值。為此，迫切需要一個(gè)多中心前瞻性研究，以探究Ki-67增殖指數(shù)與胃癌患者化療的關(guān)系。

TNM分期目前仍然是使用最為廣泛的對胃癌患者進(jìn)行分層及指導(dǎo)治療的工具，而分期越晚，患者的OS或PFS越短是業(yè)界所公認(rèn)的事實(shí)[19]。本研究也表明，在可切除胃癌患者當(dāng)中，Ⅱ/Ⅲ期患者5年總體生存率明顯低于Ⅰ期患者。但是，不同的患者，即使是TNM分期相同，經(jīng)過相同的治療后，也可能會(huì)獲得不同的生存期，TNM分期系統(tǒng)的不足日益展現(xiàn)，對TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)充是必然的趨勢。筆者發(fā)現(xiàn)聯(lián)合Ki-67增殖指數(shù)、病理分期及分化程度要比單獨(dú)使用病理分期能更準(zhǔn)確地評估患者生存結(jié)局。Ki-67增殖指數(shù)作為術(shù)后病理檢測常規(guī)項(xiàng)目之一，可以作為對TNM分期系統(tǒng)的一種補(bǔ)充，幫助更準(zhǔn)確地預(yù)測初治可切除胃癌患者術(shù)后5年生存情況，這樣有助于進(jìn)一步對患者進(jìn)行分層，指導(dǎo)后續(xù)治療方案的選擇。

本研究也存在一定的不足，Ki-67增殖指數(shù)判定可能被各種因素影響，如不同的免疫組織化學(xué)方法，不同的抗體選擇，計(jì)數(shù)病變區(qū)域的方法和病理醫(yī)師判斷標(biāo)準(zhǔn)等。

綜上所述，本研究表明，Ki-67增殖指數(shù)高與初治可切除胃癌5年總體生存率升高有關(guān)。筆者認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)可以幫助預(yù)測臨床結(jié)果和定義預(yù)后不良的患者亞組，并可用于選擇更有可能受益于輔助化療的患者。