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    電壓門控鈣離子通道藥物研究進展

    2021-04-13 12:25:36馬卓伊戚微巖高新梅徐寒梅胡加亮
    藥學進展 2021年2期
    關(guān)鍵詞:二氫吡啶離子通道失活

    馬卓伊,戚微巖,高新梅,徐寒梅,胡加亮

    (中國藥科大學 江蘇省合成多肽藥物發(fā)現(xiàn)與評價中心,江蘇 南京 211198)

    電壓門控離子通道是一類重要的膜蛋白家族,其功能構(gòu)象對細胞膜電位的變化很敏感,通過允許陽離子通過它們的成孔亞基,再沿電化學梯度向下流動而參與細胞信號傳遞[1]。電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channels,VGCC)具有共同的架構(gòu)和3 種與電壓相關(guān)的不同功能狀態(tài):封閉或靜息通道、激活或開放通道、失活通道。在去極化時,這些通道以毫秒級的速度由靜息狀態(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài),然后快速失活,在復極化時返回靜息狀態(tài)[2]。與其他電壓門控離子通道不同的是,VGCC 與許多細胞反應有關(guān),包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮和基因表達。因此,VGCC 能將細胞膜上的電信號轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)具有重要生理意義的鈣離子瞬態(tài)[1,3]。

    VGCC 是由4 ~ 5 個亞基組成的復合蛋白,這些亞基由多個基因編碼,在控制鈣離子進出的過程中發(fā)揮著不同的作用,根據(jù)α1 亞基的差異分為10 個亞型。各種亞型VGCC 在細胞信號傳導中發(fā)揮著不同的作用:CaV1 亞家族啟動神經(jīng)元的收縮、分泌、調(diào)控基因表達和突觸的轉(zhuǎn)運和整合;CaV2 亞家族主要負責在快突觸中啟動突觸傳遞;CaV3 亞家族對于節(jié)律放電細胞(如心肌細胞和丘腦神經(jīng)元)的動作電位的重復放電非常重要[4]。各種亞型VGCC 的功能障礙可能導致從心血管疾病到神經(jīng)和精神狀況的病理、生理學改變,如癲癇、疼痛和自閉癥等。

    在神經(jīng)系統(tǒng)中,鈣離子通道阻滯劑已被成功用于治療失神性癲癇,并正在成為疼痛、帕金森病、成癮和焦慮等疾病的潛在治療藥物。此外,人類鈣離子通道基因的突變還與癲癇、偏頭痛和共濟失調(diào)等疾病有關(guān)[5]。然而,目前對鈣離子通道的認識并不完善,近年來雖然有一些鈣離子通道阻滯劑進入臨床研究,如CNV-2197944、Z160 等,但進展緩慢,且開發(fā)收效甚微[6]。為改善鈣離子通道類藥物的研發(fā)現(xiàn)狀,需要對鈣離子通道及其作用機制更深入研究,以便開發(fā)出更高效、更安全的鈣離子通道阻滯劑,更好地造福人類。

    1 電壓門控鈣離子通道

    1.1 電壓門控鈣離子通道亞基的結(jié)構(gòu)和功能

    VGCC 中的10 種α1 亞基的4 個主要跨膜區(qū)具有相同的跨膜結(jié)構(gòu),每個跨膜結(jié)構(gòu)有6 個跨膜螺旋(S1、S2、S3、S4、S5 和S6),S1、S2、S3 和S4部分形成了電壓敏感域(VSD),帶正電荷的S4 部分控制電壓依賴的激活,S5 和S6 之間有一個P-loop形成可透過的通路,含有高度保守的帶負電荷的氨基酸殘基(高壓激活型鈣離子通道中為谷氨酸)協(xié)同形成孔道,對鈣、鋇、鍶等陽離子具有很高的選擇性,并且能與非透過的二價陽離子(如鎘離子)相互作用。每個跨膜結(jié)構(gòu)包含一個電壓傳感器基序,在膜去極化時響應使通道打開[7-8]。氨基末端、羧基末端以及4 個跨膜結(jié)構(gòu)之間的鏈接物面向細胞質(zhì),是第二信使調(diào)控通道功能的重要靶點[9]。高壓激活型鈣離子通道的α1 亞基與輔助亞基共同裝配后,獲得完整的通道功能[4]。

    CaVβ 亞 基 有4 個 已 知 編 碼 基 因(CaVβ1、CaVβ2、CaVβ3、CaVβ4),同時有多個選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本。CaVβ 是胞質(zhì)蛋白,與CaVα1 亞基的Ⅰ-Ⅱlinker結(jié)構(gòu)域連接。CaVβ 亞基能夠改變CaVα1 的門控特性,對增加細胞表面運輸可能起重要作用[10]。CaVα2δ亞 基 有4 種 不 同 的 類 型(CaVα2δ1、CaVα2δ2、CaVα2δ3、CaVα2δ4),作為單獨的蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯,然后裂解成CaVα2和CaVδ,再通過二硫鍵重新連接[11]。CaVα2 完全暴露在細胞外環(huán)境中,CaVδ 的作用相當于一個膜錨,通過一個磷脂酰肌醇錨定在質(zhì)膜外,CaVα2δ 的共表達能夠控制α1 亞基的運輸、定位和生物物理特性,并且能夠促進加巴噴丁類藥物(普瑞巴林和加巴噴?。┑慕Y(jié)合,抑制神經(jīng)病理性疼痛[12]。骨骼肌特異型L-型通道有輔助亞基CaVγ,它有4 個跨膜螺旋,與α1 亞基跨膜螺旋Ⅳ的VSD 區(qū)域結(jié)合。在神經(jīng)組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少于7 個潛在的CaVγ 亞型[13],但關(guān)于其功能了解很少(見圖1)。

    圖1 電壓門控鈣離子通道亞基結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Subunit structure of voltage-gated calcium channels

    1.2 電壓門控鈣離子通道的分類和亞型

    VGCC 按照電壓激活特性分類,可分為高電壓激活型(high voltage activation,HVA)和低電壓激活型(low voltage activation,LVA),HVA 通道在膜去極化程度大時響應激活,而LVA 通道在低電壓變化時即可激活,此時的膜電位與神經(jīng)元靜息膜電位相近[14];按照鈣離子電流門控特性分類,可分為L-型、P/Q-型、N-型、R-型和T-型;按照α1 亞基的基因型,可分為CaV1、CaV2、CaV3 這3 個家族,每個家族又包含多個成員[15-18](見表1)。

    CaVα1 是形成鈣離子通道亞型的決定因素。CaV1 通道家族編碼3 個不同的L-型通道(CaV1.2、CaV1.3 和CaV1.4)以及一個骨骼肌特異型CaV1.1,表現(xiàn)為激發(fā)和持續(xù)的電流時間較長,對二氫吡啶(DHP)拮抗劑和激動劑很敏感。CaV2 通道家族包括3 個成員(CaV2.1、CaV2.2 和CaV2.3)。通過選擇性剪接和裝配特定的輔助亞基,CaV2.1 產(chǎn)生了P-型和Q-型通道,它們均能被ω-agatoxin IVA(從美洲漏斗網(wǎng)蜘蛛毒液中分離的肽)阻斷。CaV2.2 編碼的N-型通道能夠被海洋捕魚軟體動物地紋芋螺Conus geographus和其毒液中分離的ω-芋螺毒素GVIA 和MVIIA 抑制。CaV2.3 對應R-型通道,能被一種從Hyristocrates GigasTarantula 的毒液中分離的多肽SNX-482 抑制[19]。CaV3 通道有3 種類型(CaV3.1、CaV3.2 和CaV3.3),全部屬于T-型鈣離子通道,通過對被鎳離子和鈣離子阻斷的相對電阻敏感性可以區(qū)分CaV3 通道不同類型[20]。

    表1 電壓門控型鈣離子通道的藥理和生理特征[15-18]Table 1 Pharmacological and physiological characteristics of voltage-gated calcium channels

    2 電壓門控鈣離子通道上市藥物及其作用機制

    2.1 L-型電壓門控鈣離子通道藥物

    L-型 鈣 離 子 通 道(L-type calcium channels,LTCC)是臨床上鈣離子通道阻滯劑的重要作用靶點,在10 個已知的α1 亞基中,有4 個屬于LTCC(CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3、CaV1.4),含有二氫吡啶類和其他有機鈣離子通道阻滯劑類藥物的高親和力結(jié)合位點,但在組織表達和門控特性方面存在差異。CaV1.1 通道幾乎只存在于骨骼肌中,CaV1.4 通道主要局限于視網(wǎng)膜中,而CaV1.2 和CaV1.3 在多種組織中有表達,甚至同時存在于同一細胞中[21]。這些通道的異常與一些疾病的發(fā)生有關(guān),如精神疾病或心律失常[22]。目前針對LTCC 的藥物有二氫吡啶類的伊拉地平(isradipine)、硝苯地平(nifedipine),苯烷胺類的維拉帕米(verapamil)以及苯二氮?類的地爾硫?(diltiazem)。雖然上述藥物的結(jié)構(gòu)不同,但它們均結(jié)合在靠近孔道和α1 亞基激活門的一段單獨重復的藥物結(jié)合區(qū)域,并與這個結(jié)合區(qū)域進行立體選擇性地可逆結(jié)合[23-24]。

    2.1.1 二氫吡啶類二氫吡啶類是一類具有廣泛生物和藥理作用的藥物,在心血管疾病的治療中廣泛應用,具有抗高血壓、抗心絞痛、擴張血管和抑制心臟等作用,1,4-二氫吡啶環(huán)為其基本支架[25]。不帶電的二氫吡啶類藥物主要穩(wěn)定和誘導失活的通道狀態(tài),它們對失活的LTCC 構(gòu)象具有很高的親和力,因此在去極化電壓較大時,二氫吡啶類藥物阻斷心血管LTCC 的半抑制濃度(IC50)很低。二氫吡啶類藥物對失活LTCC 的優(yōu)先親和性,正解釋了其能夠在治療劑量下發(fā)揮強大的血管舒張作用的同時,不影響心臟收縮力的特性[26]。

    伊拉地平(1)是美國食品和藥品管理局(FDA)批準的一種二氫吡啶鈣離子通道阻滯劑,可選擇性地與大腦海馬區(qū)CaV1.2 結(jié)合,通過抑制鈣離子流入細胞質(zhì)和抑制CaV1.2 的表達來減少β 淀粉樣低聚物的毒性,因此可用于治療阿爾茨海默病。伊拉地平對CaV1.3 也具有很高的親和力,是一種潛在可行的帕金森病的神經(jīng)保護劑[27],此外,它對高血壓也有很好的治療作用[28]。硝苯地平(2)能夠抑制CaV1.2 通道,阻止鈣離子進入細胞內(nèi)[25],使血管平滑肌得到放松,且作用濃度明顯低于對心臟產(chǎn)生顯著直接影響時的濃度,可用于治療心絞痛和高血壓[29]。

    2.1.2 苯烷胺類和苯二氮?類苯烷胺類和苯并噻吩類能夠與開放和失活狀態(tài)的通道高親和力結(jié)合。在生理狀態(tài)的pH 條件下,苯烷胺類和苯二氮?類主要以帶正電荷的有機陽離子的形式存在,在通道開放時遞送至胞質(zhì)側(cè)的結(jié)合位點[30-31];它們能穩(wěn)定通道的失活狀態(tài),減緩了通道從失活狀態(tài)中恢復的速度,從而導致頻率依賴性的抑制,其主要作用是抗心律失常[32]。

    維拉帕米(3)于1962 年由德國Knoll 公司研制成功,商品名為Isoptin,又稱為異搏定、異博停、戊脈安,是首個臨床上使用的苯烷胺類的抗心律失常、抗心絞痛、抗高血壓的藥物。維拉帕米屬于季苯烷胺類藥物,有研究表明,它以不帶電的形式穿過細胞膜,進入胞液后,以質(zhì)子化的形式進入細胞內(nèi)的孔道(α1)中并與受體位點結(jié)合,從而阻斷CaV1.2[33]。

    地爾硫?(4)屬于苯二硫氮雜?類鈣拮抗劑,通常以鹽酸鹽的形式存在,目前已有100 多個國家在臨床上用作抗心絞痛藥、降壓藥。地爾硫?能與CaV1.2 的IIIS6 和IVS6 片段結(jié)合,阻斷鈣離子進入細胞,擴張冠狀動脈,同時增加冠狀動脈血流量,從而使血壓和心率降低。與其他藥物相比,地爾硫?在降壓時沒有反射性心律加快的不良反應,不增加心肌耗氧量從而保護心臟,在臨床使用上更加安全有效[34-35]。

    2.2 N-型電壓門控鈣離子通道藥物

    N-型(CaV2.2)VGCC 主要表達在神經(jīng)末梢,控制著神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和釋放,能夠傳導電流,調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài),在傳遞疼痛信號方面發(fā)揮重要作用。N-型VGCC 的抑制劑或調(diào)節(jié)劑是治療神經(jīng)性疼痛的有效藥物[36]。

    加巴噴?。╣abapentin,5)最初于1993 年在英國獲得批準,曾被認為是一種抗癲癇藥物,現(xiàn)在也被用作治療神經(jīng)性疼痛的一線藥物,特別是糖尿病神經(jīng)痛和皰疹后神經(jīng)痛。加巴噴丁能夠與VGCC的輔助亞基α2δ1 特異性結(jié)合,抑制了在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)神經(jīng)元的突觸前末端和背角神經(jīng)元中,因神經(jīng)損傷導致的鈣離子通道α1 孔道形成單元由細胞質(zhì)向質(zhì)膜的運輸,也抑制了α2δ1 從DRG 到背角神經(jīng)元的軸向順行運輸[37-38]。普瑞巴林(pregabalin,6)是第2 代靶向α2δ1 的藥物,于2004年在歐洲被批準用于外周神經(jīng)性疼痛的控制,并作為局部癲癇的輔助治療[39]。普瑞巴林可能是通過下調(diào)脊髓瞬時陽離子通道亞家V 成員1 蛋白受體(the transient receptor potential cation channel subfamily V member 1,TRPV1)的表達來緩解神經(jīng)病理性疼痛[40],是治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛的一線藥物。

    齊考諾肽(ziconotide,商品名Prialt,見圖2)于2004 年在FDA 和歐盟獲得批準,是人工合成的ω-芋螺毒素MVIIA,能與CaV2.2 通道的特異性可逆結(jié)合,通過阻斷脊髓背角傳入神經(jīng)釋放前痛覺神經(jīng)遞質(zhì)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[41],目前用于治療阿片藥物治療無效的慢性疼痛。齊考諾肽是由25 個氨基酸組成的多肽,給藥方式為鞘內(nèi)注射。與阿片類藥物嗎啡相比,使用齊考諾肽不會產(chǎn)生急性戒斷癥狀,也沒有任何已知的上癮風險,長時間服用也不易產(chǎn)生耐受[42-43]。如果需要停止使用齊考諾肽也可以立即停止,無需減少劑量[44]。齊考諾肽的這些優(yōu)點,使其成為治療慢性疼痛,尤其是對嗎啡耐受疼痛的重要藥物,也為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛藥物提供了思路。

    圖2 齊考諾肽的球棍模型結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Ball-and-stick model of ziconotide

    2.3 R-型電壓門控鈣離子通道藥物

    R-型VGCC 屬于鈣離子通道CaV2.3 亞型,它的作用至今尚未明確。SNX-482 是一種選擇性的、電壓依賴的CaV2.3 通道抑制劑,它能與CaV2.3 的結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ相互作用,有效阻滯R-型VGCC,加大劑量后也可以阻滯L-型和P/Q-型VGCC 和鈉離子通道[45]。

    3.4 T-型電壓門控鈣離子通道藥物

    T-型VGCC 為鈣離子通道CaV3.2 亞型,是傳入性疼痛通路中疼痛信號的重要調(diào)控因子,在不同的慢性疼痛狀態(tài)下,鈣離子通道的活性受到不同程度的調(diào)控。因此,抑制DRG 神經(jīng)元和脊髓背角的T-型VGCC 可以作為鎮(zhèn)痛的靶點。T-型VGCC 在膜去極化程度較小時打開,允許鈣離子進入細胞,調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性,促進脊髓背角中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。參與疼痛信號傳導的主要CaV3 通道亞型是CaV3.2[46]。

    乙琥胺(ethosuximide,7)是T- 型VGCC 阻滯劑,臨床上用于治療失神性癲癇。乙琥胺也可以逆轉(zhuǎn)動物模型中的疼痛,但還沒有在人體中得到有效性的報道[47]。咪拉地爾(mibefradil,8)也是T-型VGCC 阻滯劑,且對CaV3.2 的阻斷強于CaV3.1和CaV3.3,可使神經(jīng)損傷引起的疼痛和神經(jīng)興奮恢復正常,在臨床上已被用于治療慢性心絞痛和高血壓[48],但是由于嚴重的藥物相互作用,咪拉地爾上市一年后被撤市,10 年后被FDA 批準為孤兒藥,用于研究其對腦癌、卵巢癌和胰腺癌的療效[49]。目前最有前景的T-型VGCC 阻滯劑是Z944(9)和ACT-709478(10),已經(jīng)進入臨床試驗階段[50]。

    2.5 P/Q-型電壓門控鈣離子通道藥物

    P/Q- 型VGCC 由基因CACNA1A編碼,選擇性剪接來自α1 亞基基因的信使mRNA 產(chǎn)生了P-型和Q-型電流(分別稱為CaV2.1a 和CaV2.1b),這些變異體可以通過對蜘蛛毒素ω-agatoxin IVA 的敏感性進行區(qū)分[51]。與P-型VGCC 相比,Q-型VGCC 失活慢,這是因為CaV2.1b 的Ⅰ-Ⅱlinker 結(jié)構(gòu)域上插入了一個氨基酸(纈氨酸)。CaV2.1 是大腦中最豐富的α1 亞基,在大鼠和人類的腎臟中也有表達[52]。

    蜘蛛毒素ω-agatoxin IVA 是一種選擇性抑制P/Q-型VGCC 的多肽,它能夠在低于10 nmol · L-1的濃度下阻滯P-型VGCC,而在較高的濃度下阻滯Q-型VGCC,但是由于它的相對分子質(zhì)量較大,不適合作為臨床藥物使用[53]。

    3 結(jié)語

    VGCC 不僅能夠改變細胞電位,還能進行信號轉(zhuǎn)導,這賦予了VGCC 更加廣泛的功能。近年來,隨著實驗技術(shù)的提高和研究手段的改進,VGCC 的結(jié)構(gòu)得到了進一步解析,這促進了VGCC 阻滯劑的發(fā)現(xiàn)及進入臨床應用。L-型VGCC 在抗高血壓、抗心律失常和抗心絞痛方面發(fā)揮重要作用,L-型VGCC阻滯劑如二氫吡啶類的硝苯地平、伊拉地平,苯烷胺類的維拉帕米,苯二硫氮雜?類的地爾硫?等,均在臨床上得到了廣泛的應用[27,29,33-35]。N-型和T-型VGCC 阻滯劑與鎮(zhèn)痛關(guān)系密切,如加巴噴丁和普瑞巴林[12];近年來對動物毒素的研究越來越多,動物毒性肽如齊考諾肽的上市為開發(fā)此類藥物提供了新的思路[41-44];此外,甚至發(fā)現(xiàn)了T-型VGCC 的抗癌作用[54]。R-型和P/Q-型VGCC 的研究較少,對其功能的了解尚不完善,目前也沒有相關(guān)藥物上市。本文對上述VGCC 的結(jié)構(gòu)、作用靶點和上市藥物進行了概述(見表2),期望為其后續(xù)研發(fā)提供參考。

    筆者所在課題組從齊考諾肽的發(fā)現(xiàn)和應用中受到啟發(fā),選擇了少棘蜈蚣(Scoropendra subspinipes mutilans)這一傳統(tǒng)中藥材,通過構(gòu)建cDNA 文庫,使用高通量測序技術(shù)測序后,在得到的蛋白質(zhì)序列中篩選具有鎮(zhèn)痛活性的多肽并進行活性研究,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有一定活性的多肽片段。目前正在對這些多肽片段進行進一步的活性評價,期待它們能表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效果。

    表2 電壓門控型鈣離子通道藥物的靶點和適應證Table 2 Targets and indications of voltage-gated calcium ion channel drugs

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