止血精膠囊止血活性評價及穩(wěn)定性考察*

梅瑤，關(guān)煥玉，廖尚高，席曉嵐

(貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴安新區(qū) 550025；國家苗藥工程技術(shù)中心 &民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

白芨(Bletillastriata)為蘭科植物白芨的干燥塊莖，多年生草本，是歷版《中國藥典》收載的常用藥之一[1-2]，具有收斂止血、消腫生肌、清熱利濕之功效[3-8]，在臨床上主要用于咯血、吐血以及外傷出血、皮膚皸裂、瘡瘍腫毒、肺結(jié)核吐血、潰瘍病出血等病癥[8-15]。白芨總提物經(jīng)大孔樹脂色譜柱進行組分分離后，去除了強水溶性成分和強親脂性成分，獲得的白芨的80%乙醇洗脫組分(BS-80EE)中含有大量的非多糖類化合物[16]。藥理學研究發(fā)現(xiàn)[17-20]，白芨非多糖組分能夠顯著縮短肝素化的小鼠凝血時間(bleeding time,BT)和出血時間(clotting time,CT)；可刺激大鼠血小板活化，增強血小板聚集；可作用于凝血纖溶系統(tǒng)，加速血液凝固，抑制纖維蛋白降解；同時使血液黏度增加，血流速度變慢發(fā)揮止血作用。白芨非多糖組分化學成分豐富，且止血療效顯著。為了進一步開拓白芨非多糖的應(yīng)用，本課題組在前期研究中，通過濕法制粒，將白芨非多糖和輔料微晶纖維素以1 ∶1比例制成顆粒后，裝入膠囊殼制得止血精膠囊，該制劑和白芨非多糖粉末相比，降低了白芨非多糖粉末的吸潮性，進而也提高了白芨非多糖的穩(wěn)定性。然而，止血精膠囊的止血活性仍未進行考察和驗證，且在生產(chǎn)、貯存與使用期間過程中的穩(wěn)定性也未行考察。因此，本文以小鼠全身肝素化的BT和CT作為指標，比較白芨粗提物與白芨非多糖止血精膠囊的止血療效，并參照2015版《中國藥典》四部通則9001原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則[21]，以水分、性狀、崩解時限及含量測定等為指標，對該制劑進行穩(wěn)定性考察。

1 資料與方法

1.1 藥品、動物、儀器

1.1.1藥品 止血精膠囊(實驗室自制)、militarine對照品(批號DST-190219-100，成都德思特生物技術(shù)有限公司)、云南白藥(YNBY，批號ZLA1736 20181210，云南白藥集團股份有限公司)、肝素鈉注射液(批號1113H0212，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)，乙酸乙酯、氯仿、硫酸均為分析純，甲醇為色譜純，水為屈臣氏水。

1.1.2動物 清潔級昆明小鼠共180只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司 ，許可證號SCXK(湘)2019-0005。實驗期間動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫18～24 ℃，環(huán)境安靜，動物隨意進食進水，明暗12 h循環(huán)飼養(yǎng)。所有動物于試驗前24 h禁食不禁水。

1.1.3儀器 十萬級AE2401型電子天平(梅特勒，托利多儀器上海有限公司)、CX250型超聲波清洗機(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)、SC082767型實驗室專用純水機(四川沃特水處理設(shè)備有限公司)、DZF-6050真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、ZB-1d型升降崩解儀(南京溫諾儀器有限公司)、Aglient 1260型高效液相色譜儀、藥品穩(wěn)定試驗箱(上海三騰儀器有限公司)、HT-D40型恒溫箱(深圳市宇泰試驗設(shè)備有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1白芨粗提物的提取 白芨塊莖經(jīng)粉碎機打成粉末，稱取白芨粉末2 kg，按料液比分別為1 ∶10、1 ∶8、1 ∶8的比例加入蒸餾水，煎煮提取3次，1 h/次，合并3次提取液，過濾，濃縮至浸膏，55 ℃真空干燥得白芨粗提物29.41 g，提取率為6.8%。

1.2.2止血精膠囊的制備 白芨塊莖經(jīng)粉碎機打成粉末(過4號篩)，按料液比1 ∶4的比例加入95%乙醇回流提取，2 h/次，提取3次。合并3次濾液后濃縮至浸膏，浸膏用水溶解后上大孔樹脂D101柱色譜(樹脂6 cm,75 cm)，經(jīng)水洗脫后，用80%乙醇溶液洗脫，收集并合并80%乙醇洗脫液，濃縮至稠膏，55 ℃真空干燥，制得白芨非多糖浸膏粉，浸膏粉(過60目篩)與稀釋劑微晶纖維素按1 ∶1混勻，加入一定量的75%乙醇作為潤濕劑(噴灑加入、少量多次)制軟材直至“手握成團、觸之即散”。過20目篩擠壓制粒，將濕顆粒于60 ℃下干燥，取干燥好的顆粒整粒，過40～80目篩，去除細粉，即得粒度介于40～80目的膠囊填充物，裝入3號空心膠囊，即得止血精膠囊。

1.2.3止血精膠囊止血活性考察 (1)全身肝素化小鼠CT的測定。取健康昆明小鼠90只，雌雄各半，隨機分為9組(每組10只)，為空白對照組、云南白藥組(0.667 g/kg)、肝素鈉模型組(70 U/kg)、白芨粗提物低、中、高劑量組(按生藥量計為2.5、5.0和10.0 g/kg)和止血精膠囊低、中、高劑量組(按生藥量計為2.5、5.0和10.0 g/kg)。各組小鼠每天灌胃給藥1次，空白組和模型組分別按20 mL/kg劑量給予蒸餾水，其余各組均給予相應(yīng)劑量的藥物，連續(xù)給藥5 d；末次灌胃給藥60 min后，除空白組外其余各組均尾靜脈注射肝素鈉(70 U/kg)，15 min后用手術(shù)刀于距小鼠尾尖0.5 cm處割斷，待血液自行溢出時開始計時，每隔30 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止(濾紙吸時無血跡)。以人工形成創(chuàng)面出血到出血停止所經(jīng)時間計為小鼠CT。(2)全身肝素化小鼠BT的測定。取健康昆明小鼠90只(雌雄各半)，隨機分為10組，每組10只，分組及給藥方法同“全身肝素華小鼠CT的測定”；于第5天灌胃給藥60 min后，除空白組外其余各組均尾靜脈注射肝素鈉(70 U/kg)，15 min后用眼科彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球即有血液流出 ,于載玻片上滴 1滴血(血滴直徑約 5 mm)后立即記時,每隔30 s用清潔大頭針自血滴邊緣由外向內(nèi)輕輕挑動 1次,并觀察有無血絲挑起，從采血開始至挑起血絲止,記錄所用時間即為BT。

1.2.4止血精膠囊穩(wěn)定性考察 (1)高溫試驗：取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量，置于潔凈的培養(yǎng)皿中，置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放至第5天和第10天取樣，按《中國藥典》2015版四部通則9001法規(guī)中規(guī)定檢測重點檢查項目，與0天測定結(jié)果比較；如果樣品含量下降5%，則需要在40 ℃條件下同法進行試驗。(2)高濕試驗：取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量于潔凈的培養(yǎng)皿中，置于溫度為25 ℃、濕度為(75±5)%恒溫培養(yǎng)箱中，放置5 d和10 d后取樣，按相關(guān)要求按相關(guān)要求對膠囊外觀性狀、水分、崩解時限、白芨苷含量及薄層進行檢測。(3)強光照射試驗：取自制膠囊樣品內(nèi)容物適量置于光照為(4 500±500) lx的光照箱中，分別在第5天和第10天取樣測定。(4)加速試驗：隨機抽取3批自制止血精膠囊，分別用鋁箔紙包裹嚴密，置于溫度為(40±2)℃、相對濕度為(75± 5)%的恒溫培養(yǎng)箱中，分別于第3個月、第6個月取樣1次，按止血精膠囊穩(wěn)定性重點考察項目，以水分、性狀、崩解時限、白及苷含量及薄層為指標進行測定。

1.2.5白芨苷含量的測定 (1)色譜條件：Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 nm×5 μm)，保護柱為Phenomenex Security Guard C18；柱溫40 ℃，流動相為甲醇 ∶水(40 ∶60)，檢測波長為223 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL；理論塔板數(shù)以白芨苷計數(shù)應(yīng)不低于5 000，白芨苷與其它色譜峰分離度>1.5。(2)對照品溶液的制備：精密稱取白芨苷標準品5.09 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容后，制成濃度為0.509 g/L的儲備溶液，取儲備液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL，分別置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻，制得濃度為40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列對照品溶液，白芨苷檢測濃度線性范圍為5.09～40.72 mg/L。(3)供試品溶液的制備：稱取膠囊內(nèi)容物0.2 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流處理2 h，冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。(4)陰性樣品溶液的制備：按照止血精膠囊處方比例及制備工藝，制備缺白芨非多糖組分的陰性樣品溶液，按“供試品溶液的制備”方法處理，即得。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 止血精膠囊與白芨粗提物體內(nèi)藥效考察

小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后，與空白組比較，模型組小鼠的CT和BT明顯延長(P<0.01)，說明小鼠出血模型建模成功(圖1)。與模型組相比，止血精膠囊和白芨粗提物各劑量組均能明顯縮短全身肝素化小鼠的CT和BT(P<0.01或P<0.05)，呈劑量依賴性；止血精膠囊組小鼠的BT、CT縮短率均較白芨粗提物組高。與云南白藥組比較，止血精膠囊高劑量組小鼠的BT和CT縮短(P<0.01)，而白芨粗提物高劑量組小鼠的BT和CT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；止血精膠囊低、中、高劑量組的BT和白芨粗提物低、中、高劑量組相比，縮短率分別增加了20.7%、19.7%、15.9%，而CT分別增加了11.6%、13.7%、25.2%。因此推測止血精膠囊體內(nèi)止血活性優(yōu)于白芨粗提物。

注：(1)與空白組比較，P<0.01；與肝素鈉模型組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01。圖1 止血精膠囊和白芨粗提物不同劑量組對全身肝素化小鼠BT、CT的影響Fig.1 Effects of different dosages of hemostatic capsules and bletilla striata extracts on BT and CT of heparinized mice

2.2 止血精膠囊穩(wěn)定性考察

經(jīng)穩(wěn)定性試驗處理后，對止血精膠囊外觀性狀、水分、崩解時限以及白芨苷含量進行考察。

2.2.1影響因素試驗 (1)高溫試驗：樣品經(jīng)0、5、10 d高溫(60 ℃)試驗，3批膠囊內(nèi)容物仍呈黃棕色顆粒、含水量分別為4.82%，4.75%和5.02%，均低于9.0%；崩解時限分別為5、6和6 min，崩解時間無變化(P>0.05)；3批膠囊白芨苷含量分別為26.72、26.63和26.52 mg/g，含量無明顯變化(P>0.05)，表明膠囊在高溫下穩(wěn)定。(2)高濕試驗：樣品在溫度為25 ℃、相對濕度為(75 ± 5)%的高濕度環(huán)境下進行0、5、10 d試驗，3批膠囊內(nèi)容物含水量分別為4.82%、4.75%和5.02%，崩解時限無明顯變化(P>0.05)，白芨苷含量分別為26.72、25.42和25.92 mg/g，表明膠囊在高濕下較穩(wěn)定。(3)強光照射試驗：樣品經(jīng) 0、5、10 d (4 500±500)lx 強光照，3批膠囊內(nèi)容物仍均為黃棕色顆粒，含水量均低于9.0%(分別為4.90%、3.28%、2.15%)，崩解時限均<30 min，符合藥典對硬膠囊的規(guī)定；3膠囊白芨苷含量分別為26.459、26.508、26.526 mg/g，即白芨苷含量物無明顯變化(P>0.05)，表明膠囊在強光照射下穩(wěn)定。

2.2.2加速試驗 由表1可知，樣品經(jīng)6個月加速試驗的考察，其性狀、有關(guān)物質(zhì)、含量等與0月比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明本品在常規(guī)包裝時比較穩(wěn)定。

表1 止血精膠囊加速試驗結(jié)果Tab.1 Results of accelerating test of hemostatic capsules

3 討論

白芨作為我國傳統(tǒng)的生肌止血藥，在臨床上具有顯著意義[22-23]。前期研究已發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分具有較強的止血活性，利用高壓液相色譜—電噴霧—四級桿—飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)指認了白芨非多糖部位的12個色譜峰，發(fā)現(xiàn)其中的單體化合物4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside、blestroside和gymnoside I等能顯著促進血小板聚集作用。白芨苷、4-hydroxymethylphenyl β-D-glucoside和α-isobutylmalic acid等化合物可顯著縮短肝素化小鼠的CT 值[20]。為了避免白芨非多糖組分粉末的吸潮性，本課題組通過白芨非多糖組分的膠囊劑工藝制備，獲得止血精膠囊，并對止血精膠囊的止血活性和穩(wěn)定性進行了評價，發(fā)現(xiàn)止血精膠囊能夠明顯縮短小鼠全身肝素化的CT和BT，且止血活性強于白芨粗提物，為白芨藥材及其制劑的開發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。

在進行樣品穩(wěn)定性試驗考察時，根據(jù)2015版中國藥典四部對膠囊劑穩(wěn)定性(指導(dǎo)原則9001)，取3批市售制劑，進行10 d的影響因素試驗和6個月的加速試驗，除了對主要成分白芨苷薄層鑒定和含量測定外，還分別考察了外觀形狀、含水量以及崩解時限，均符合質(zhì)量標準要求。說明在目前采用的模擬市場包裝下，該產(chǎn)品在6個月內(nèi)其內(nèi)在質(zhì)量和穩(wěn)定性良好，這也為以后該藥品的儲存條件和生產(chǎn)條件提供了可靠的理論依據(jù)。