食物中毒常見(jiàn)天然毒素及其檢測(cè)技術(shù)

張琳，金玉娥，汪國(guó)權(quán)

1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津 300052

2.上海市疾病預(yù)防控制中心化學(xué)品毒性檢定所，上海 200336

食物中毒是指攝入含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)的食品，或把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食品攝入后所出現(xiàn)的非傳染性的急性、亞急性疾病。食物中毒原因包括細(xì)菌性、真菌性、有毒動(dòng)植物和化學(xué)性食物中毒，其中有毒動(dòng)植物及毒蘑菇引起的食物中毒的死亡人數(shù)最多，主要致毒成分為其中的天然毒素。天然毒素，即生物毒素，是指生物來(lái)源并不可自復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)，包括動(dòng)物、植物、微生物在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中或一定條件下產(chǎn)生的，對(duì)其他生物物種有毒害作用的各種化學(xué)物質(zhì)。天然毒素具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、檢測(cè)難度大、中毒劑量小、致死率高的特點(diǎn)，因此越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。

有毒動(dòng)植物及毒蘑菇中毒事件的發(fā)生呈現(xiàn)一定的地域性和季節(jié)性。有毒植物中毒集中在植物茂密、植物品種多樣的西南和華南地區(qū)，植物多為有藥用價(jià)值或加工后可食用的植物。有毒動(dòng)物中毒事件多發(fā)于春夏季，東部沿海地區(qū)，以海洋毒素為主。毒蘑菇中毒高發(fā)于每年夏秋季，集中在云貴川一帶［1］。本文梳理常見(jiàn)有毒動(dòng)植物及毒蘑菇中天然毒素成分，及典型毒素中毒的臨床癥狀，并對(duì)其檢測(cè)方法加以總結(jié)。

1 毒性成分

1.1 植物毒素

我國(guó)有毒植物約1 300多種，毒素的種類(lèi)復(fù)雜，主要毒素按其結(jié)構(gòu)可分為生物堿類(lèi)、萜類(lèi)、苷類(lèi)、氨基酸多肽及蛋白質(zhì)（表1），其中致死率最高的植物為烏頭、鉤吻和毒蜂蜜［1］。烏頭和鉤吻致毒的成分為烏頭堿、鉤吻堿及其類(lèi)似物。由于烏頭形似“野芹菜”，而鉤吻形似金銀花，易誤食引起中毒。另外，民間許多植物常被用于泡制“養(yǎng)生”藥酒，因誤食導(dǎo)致中毒也較為常見(jiàn)。烏頭堿加熱水解后，毒性可降低，烹煮加熱不當(dāng)，生物堿水解不徹底，亦可造成中毒。毒蜂蜜的毒素較為復(fù)雜，大多由于蜜蜂采蜜過(guò)程中采到有毒植物（如雷公藤）的花粉，使植物毒素富集在蜂蜜中，食用后中毒，因此毒蜂蜜中毒的毒素需要根據(jù)臨床癥狀進(jìn)一步加以判斷。

表1 常見(jiàn)植物毒素種類(lèi)及主要成分Table 1 The types and components of common phytotoxins

1.2 海洋毒素

海洋毒素的形成與毒藻密切相關(guān)，有些毒藻被魚(yú)貝類(lèi)生物攝入后，毒素會(huì)在魚(yú)體內(nèi)富集，被人食用后引起中毒。海洋毒素主要有河豚毒素、貝類(lèi)毒素及雪卡毒素三類(lèi)（表2）。河豚毒素存在于多種海洋及陸生動(dòng)物中，是一類(lèi)籠形原酸酯類(lèi)生物堿，易溶于水，且分子中幾乎所有碳原子均有不對(duì)稱(chēng)取代，目前已分離鑒定出的河豚毒素類(lèi)似物有20 余種。貝類(lèi)毒素廣泛分布于海洋生物中，種類(lèi)繁多，按結(jié)構(gòu)可分為8 類(lèi)，分別為原多甲藻酸（azaspiracid，AZA）、短裸甲藻毒素（brevetoxin，BTX）、環(huán)亞胺類(lèi)（cyclic Imine，CI）、軟骨藻酸（domoic acid，DA）、大田軟海綿酸（okadaic acid，OA）、扇貝毒素（pectenotoxin，PTX）、石房蛤毒素（saxitoxin，STX）和蝦夷扇貝毒素（yessotoxin，YTX）。AZA、CI、OA、BTX、PTX和YTX 6類(lèi)均為聚醚類(lèi)物質(zhì)，屬于脂溶性貝類(lèi)毒素；而STX 和DA 為水溶性貝類(lèi)毒素，其中STX 為氨基甲肽類(lèi)毒素，DA 為多莫酸毒素。雪卡毒素存在于珊瑚礁魚(yú)類(lèi)中，為階梯狀的大環(huán)聚醚類(lèi)分子，按來(lái)源分為太平洋雪卡毒素（pacific ciguatoxin，P-CTX）、加勒比海雪卡毒素（Caribbean ciguatoxin，C-CTX）和印度洋雪卡毒素（Indian ciguatoxin，I-CTX），其中P-CTX-1 為已知含量最高且毒性最強(qiáng)的雪卡毒素。海洋毒素多為熱穩(wěn)定性物質(zhì)，常規(guī)烹飪難以去除［2］。

表2 常見(jiàn)海洋毒素種類(lèi)及主要成分Table 2 The types and components of common marine toxins

1.3 蘑菇毒素

我國(guó)有毒蘑菇約四百多種，大多為鵝膏菌屬。蘑菇毒素根據(jù)結(jié)構(gòu)分為鵝膏毒肽、鬼筆毒肽和氨基酸生物胺3類(lèi)（表3），其中鵝膏毒肽和鬼筆毒肽均為環(huán)形多肽結(jié)構(gòu)。鵝膏毒肽中的α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽毒性較強(qiáng)且含量較高，為鵝膏菌中毒死亡的主要原因［3］。鵝膏毒肽化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐加熱、干燥，因此烹飪過(guò)程通常無(wú)法破壞其毒性。

表3 常見(jiàn)蘑菇毒素種類(lèi)及毒素成分Table 3 The types and components of common mushroom toxins

2 典型毒素中毒的臨床癥狀及救治

2.1 植物毒素

烏頭中毒后表現(xiàn)為口舌及四肢麻木、嘔吐腹瀉，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的惡性心律失常，甚至死亡。鉤吻在進(jìn)食30 min 后發(fā)病，主要表現(xiàn)為呼吸困難甚至死亡［4］。2015年，云南一村民家中聚餐誤食草烏，造成27人中毒，其中6人死亡。

2.2 海洋毒素

河豚毒素和以STX 為代表的麻痹性貝毒可引起神經(jīng)系統(tǒng)中毒，表現(xiàn)為麻木，唇、舌熱痛，并傳到面部和指尖，肌肉喪失協(xié)調(diào)性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)麻痹甚至死亡。以O(shè)A、AZA 等為代表的腹瀉性貝毒在食用30 min 至數(shù)小時(shí)后會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和胃痙攣等消化系統(tǒng)癥狀。以BTX 為代表的神經(jīng)性貝毒中毒表現(xiàn)為3 h 內(nèi)發(fā)生面部刺痛且傳至身體其他部位，忽冷忽熱，瞳孔擴(kuò)大且有醉酒感。以DA 為代表的失憶性貝毒中毒表現(xiàn)為腸內(nèi)不適，重癥時(shí)出現(xiàn)面部怪相或咬牙，短期記憶喪失和呼吸困難。雪卡毒素潛伏期2～10 h，典型中毒癥狀為“熱感顛倒”，當(dāng)觸摸熱的物體時(shí)，會(huì)產(chǎn)生冷覺(jué)［5］。

2.3 蘑菇毒素

蘑菇中毒后都伴有不同程度的消化道癥狀，根據(jù)不同的品種可進(jìn)一步分為急性肝損傷、急性腎損傷、神經(jīng)型、急性胃腸炎型、溶血型、橫紋肌溶解型和過(guò)敏皮炎型。其中致死率最高為急性肝損傷和橫紋肌溶解。急性肝損傷在誤食后6～12 h出現(xiàn)胃腸道癥狀，胃腸道癥狀消失后會(huì)出現(xiàn)假愈期，假愈期后迅速惡化，出現(xiàn)肝功能異常及多器官衰竭。橫紋肌溶解在誤食1 h內(nèi)便出現(xiàn)消化道癥狀，24 h 后出現(xiàn)明顯肌痛并伴有醬油尿，同時(shí)肌酸激酶急劇上升［6］。2015年無(wú)錫一起蘑菇中毒事件，造成7 人中毒，其中4 人死亡，食用的即為可導(dǎo)致急性肝損的裂皮鵝膏。

食物中毒救治在明確病因后，首先需要快速排泄毒物，主要以洗胃、導(dǎo)瀉、利尿?yàn)橹鳎瑢?duì)于劇毒物質(zhì)必要時(shí)需加以血液透析。其次需對(duì)癥治療，針對(duì)不同疾病的癥狀進(jìn)行對(duì)癥支持療法。針對(duì)一些臨床實(shí)踐中有特效藥物的毒素，可采用特效藥物，例如肝損傷性毒蘑菇宜選用水飛薊素，毒蕈堿類(lèi)蘑菇中毒宜選用阿托品。

3 檢測(cè)技術(shù)

3.1 植物毒素

小分子植物毒素通常采用液質(zhì)聯(lián)用（liquid chromatography tandem mass spectrometer，LC/MS）檢測(cè)，前處理過(guò)程除了傳統(tǒng)的液液萃?。?-8］外，還可進(jìn)行固相萃取技術(shù)（solid-phase extraction，SPE）［9］或QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe）［10-12］進(jìn)行凈化。Martinell等［10］使用QuEChERS建立的10種生物堿的提取方法可達(dá)到與SPE 相同的回收率，方法更加省時(shí)。Ha 等［13］基于基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）直接檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，測(cè)定馬鈴薯塊莖中的龍葵堿類(lèi)物質(zhì)及其分布，避免了其他方法中復(fù)雜的前處理過(guò)程。Ouyang 等［8］建立了血清中雷公藤的檢測(cè)方法，相對(duì)于傳統(tǒng)的食物檢測(cè)方法，在未知暴露途徑或食物殘?jiān)y以獲得的情況下，仍可快速檢測(cè)；另外，雷公藤個(gè)體代謝差異較大，生物樣本可以更好地反映不同患者的中毒情況。

植物毒素類(lèi)似物多，不同植物的不同部位會(huì)在不同生長(zhǎng)周期形成一系列結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，它們的標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得，但具有相似的質(zhì)譜裂解行為，可通過(guò)質(zhì)譜對(duì)中性丟失或子離子碎片掃描，實(shí)現(xiàn)毒素的推測(cè)與鑒定。Vaclavik 等［11］基于液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜（liquid chromatography tandem quadrupole orcitrap mass spectrometer，LC-Q-orbitrap MS）使用QuEChERS同時(shí)測(cè)定食物中毒素及其代謝物，使用dd-MS/MS（data-dependent MS/MS）掃描不同碰撞能下的化合物子離子碎片，實(shí)現(xiàn)高通量的快速篩查。

蓖麻毒素和相思子毒素為蛋白質(zhì)類(lèi)結(jié)構(gòu)，可采用免疫法凈化或測(cè)定［14-16］。Liu 等［14］基于便攜式傳感器和磁分離免疫測(cè)定技術(shù)，以絲網(wǎng)印刷電極為反應(yīng)中心，實(shí)現(xiàn)了相思子毒素的快速檢測(cè)，僅需5 μL 樣品，靈敏度達(dá)0.1 ng·mL-1，與Hansbauer 等［15］建立的質(zhì)譜方法相比，設(shè)備易于攜帶，檢測(cè)時(shí)間短，但缺點(diǎn)是對(duì)于同型化合物難以區(qū)分。常見(jiàn)植物毒素及其檢測(cè)方法見(jiàn)表4。

表4 常見(jiàn)植物毒素及其檢測(cè)方法Table 4 Common phytotoxins and detection methods

3.2 海洋毒素

目前常用的海洋毒素檢測(cè)方法有生物法、免疫法和色譜法。生物法采用小鼠生物檢測(cè)法，根據(jù)注入毒素后小鼠的存活時(shí)間評(píng)判毒性。國(guó)標(biāo)中對(duì)河豚毒素、腹瀉性貝類(lèi)毒素和麻痹性貝類(lèi)毒素的檢測(cè)均采用了該法。生物法操作簡(jiǎn)單，但無(wú)法測(cè)定毒素組成，受小鼠種屬及個(gè)體差異影響較大，重現(xiàn)性差，同時(shí)因使用大量小鼠，引起倫理學(xué)爭(zhēng)議。

免疫法根據(jù)抗原-抗體反應(yīng)對(duì)毒素定量，檢測(cè)方便、快速。Thattiyaphong 等［17］開(kāi)發(fā)了基于測(cè)流免疫層析的快速檢測(cè)方法，僅需5 min 便可完成對(duì)TTX 的檢測(cè)，適用于對(duì)大批量水產(chǎn)品的快速篩查。但與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）［18］一樣，免疫法對(duì)于衍生物較多的化合物均不易檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)化合物的高通量篩查，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果存在假陽(yáng)性，仍需質(zhì)譜進(jìn)一步復(fù)測(cè)。Zheng 等［19］開(kāi)發(fā)了新適配體（M-30f），用于檢測(cè)STX，與原適配體（APTSTX1）相比，親和力提高了30 倍，同時(shí)較高的選擇性可以降低假陽(yáng)性率，但適配體的尋找較為困難，難以廣泛應(yīng)用。

LC/MS 由于具有較高的靈敏度和選擇性，已逐漸成為海洋毒素檢測(cè)的主流方法，不僅可以檢測(cè)食物樣本，還可通過(guò)檢測(cè)患者體液確定毒素［20］。河豚毒素結(jié)構(gòu)特殊，需用酸提取，國(guó)標(biāo)還通過(guò)免疫親和柱，提高靈敏度。對(duì)于其高極性，Rodríguez 等［21］比較了3 種色譜柱后得出使用氨基柱可以更好地分離TTX 及其衍生物。貝類(lèi)毒素結(jié)構(gòu)多樣，脂溶性和水溶性兼有，給提取和檢測(cè)增加了難度。Rey 等［22］整合多種凈化手段，采用鹽酸酸化提取除去蛋白，并使用二氯甲烷提取后經(jīng)Hypercarb 小柱凈化，將基質(zhì)效應(yīng)均控制在15%以?xún)?nèi)，并在20 min 內(nèi)完全分離。Chen 等［23］使用反向色譜串聯(lián)親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC），實(shí)現(xiàn)了親脂性和親水性貝類(lèi)毒素的同時(shí)篩查。部分貝類(lèi)毒素因含有酸堿基團(tuán)，可與衍生化試劑反應(yīng)引入熒光基團(tuán)，因此熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）也常用于海洋毒素的檢測(cè)。Mccarron 等［24］將AZA 中的羧基與9-蒽重氮甲烷（9-anthryldiazomethane，ADAM）衍生化，經(jīng)熒光檢測(cè)器分析，檢測(cè)限達(dá)40 μg·kg-1，提供了AZA 檢測(cè)的新思路。麻痹性貝類(lèi)毒素的堿性基團(tuán)在過(guò)堿性條件下被氧化成熒光衍生物，經(jīng)在線柱后衍生反應(yīng)進(jìn)行熒光檢測(cè)，方法靈敏度達(dá)50 μg·kg-1，與質(zhì)譜相當(dāng)，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，使用試劑多而污染環(huán)境［25］。

貝類(lèi)毒素由于種類(lèi)繁多，一些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)常難以大量獲取，給準(zhǔn)確定量帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。因此，通常使用類(lèi)似物，用以作半定量的對(duì)照，但由于不同化合物在電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）中靈敏度差異很大，因此方法準(zhǔn)確度不高。Qiu 等［26］提出以GTX2為參照物，測(cè)定相同條件下其他組分的相對(duì)響應(yīng)因子值，并基于此進(jìn)行半定量，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)絕對(duì)定量結(jié)果相差±20%以?xún)?nèi)。常見(jiàn)海洋毒素及其檢測(cè)方法見(jiàn)表5。

表5 常見(jiàn)海洋毒素及其檢測(cè)方法Table 5 Common marine toxins and detection methods

3.3 蘑菇毒素

中毒樣本可選取食物、血漿和尿液，食用蘑菇后6～72 h 在尿液中均有檢出，而血漿樣本僅在24 h 內(nèi)檢出［30］。蘑菇毒素的前處理大多采用SPE 凈化，但固相萃取法耗時(shí)長(zhǎng)，Ginterová 等［31］將尿液稀釋過(guò)膜后直接進(jìn)行毛細(xì)管電泳色譜串聯(lián)質(zhì)譜（capillary electrochromatography tandem mass spectrometer，CE/MS/MS）檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到0.05～0.73 ng·mL-1。Helfer等［32］使用在線快速提取串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用，將全流程分析時(shí)間縮短至15 min，極大提高了前處理的效率及分析速度。

LC 和少數(shù)氣相色譜法（gas chromatography，GC）均可用于進(jìn)行蘑菇毒素的檢測(cè)（表6），其中肽類(lèi)毒素主要通過(guò)LC分析，而小分子生物胺可以衍生化后通過(guò)GC分析。Lei等［33］基于Orbitrap MS對(duì)蘑菇樣品進(jìn)行產(chǎn)物離子和中性丟失掃描，篩選定量三種毒素，并初步鑒定了兩種未知毒素。Abbott等［34］使用同位素標(biāo)記α-鵝膏毒肽作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定尿液中蘑菇毒素，靈敏度雖與Zhang等［35］的方法相近，但色譜分析時(shí)間可縮短至3 min。Rácz 等［36］考察三種HILIC 柱鍵合相在下不同色譜條件下對(duì)蘑菇毒素的保留行為，并基于此建模，尋找最優(yōu)分離條件。St?íbrny 等［37］采用離子交換柱對(duì)尿液中蠅蕈醇和異煙酸進(jìn)行凈化后通過(guò)氯甲酸乙酯衍生化，并經(jīng)GC 定量分析，方法應(yīng)用于4 例患者，表明肌酐及時(shí)間校準(zhǔn)后的濃度，與中毒癥狀具有相關(guān)性。

表6 常見(jiàn)蘑菇毒素及其檢測(cè)方法Table 6 Common mushroom toxins and detection methods

4 討論及展望

有毒動(dòng)植物及毒蘑菇中毒素種類(lèi)復(fù)雜多樣，毒性高，為相關(guān)食物中毒的快速檢測(cè)、應(yīng)急處置與防治帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，因此建立快速、靈敏、特異性高的毒素檢測(cè)技術(shù)已成為應(yīng)對(duì)食物中毒的關(guān)鍵。質(zhì)譜分析技術(shù)因具有強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)確認(rèn)能力，已逐步成為中毒物確認(rèn)的主要技術(shù)手段，加之不同前處理技術(shù)和色譜聯(lián)用技術(shù)，可以在干擾物去除，多組分分離與確認(rèn)，基質(zhì)干擾降低或消除等方面提升質(zhì)譜技術(shù)水平，提升中毒毒物確認(rèn)的靈敏度和特異性水平，因此逐漸成為食物中毒理化檢測(cè)的主流方法。尤其近年來(lái)，基于高分辨質(zhì)譜精確的分子量測(cè)定能力和離子淌度技術(shù)對(duì)具有空間結(jié)構(gòu)差異的化合物的分離能力，天然毒物同分異構(gòu)體的測(cè)定得以實(shí)現(xiàn)；同時(shí)，聯(lián)合原位電離質(zhì)譜技術(shù)的現(xiàn)場(chǎng)確認(rèn)能力，毒物檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒂懈筇嵘?。樣品前處理方面，由于檢測(cè)樣本多為基質(zhì)復(fù)雜的食品及生物樣本，因此需要基于毒素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和樣本特性，選擇提取和凈化方法，以最大程度保留待測(cè)成分。

目前，毒素檢測(cè)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，因流行病學(xué)調(diào)查的不完整，毒源樣品消失，中毒個(gè)案化毒物樣品的存在，低含量但劇毒的毒素難以識(shí)別，毒素多樣性和標(biāo)準(zhǔn)品缺乏等多種原因，一些食物中毒的原因尚無(wú)法確定。另一方面，針對(duì)天然毒素多樣性，異構(gòu)體繁多，體內(nèi)毒物代謝過(guò)程難以確認(rèn)，毒物經(jīng)代謝極性增大等特點(diǎn)，特異的檢測(cè)方法較少，加之毒物樣本的復(fù)雜和多樣，更增加了檢測(cè)的難度。

今后，隨著數(shù)據(jù)及智能化的發(fā)展，基于多種色譜聯(lián)用技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)及有毒物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的智能化，未知毒素識(shí)別及預(yù)測(cè)將成為可能，這將有助于尋找更多新的毒素并定向篩查。同時(shí)，隨著原位電離質(zhì)譜技術(shù)和生物試劑盒的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)常見(jiàn)毒素的快速便捷化檢測(cè)。