人角膜基質透鏡長期超低溫保存的可行性評估

韋琦 丁輝 鐘探 余瀚洋 楊鎮(zhèn)朵 范紅明 何林藝 鐘興武

1中山大學中山眼科中心 眼科學國家重點實驗室 廣東省眼科視覺科學重點實驗室，廣州 510060；2中山大學中山眼科中心海南眼科醫(yī)院 海南省眼科學重點實驗室，海口 570300

角膜供體來源匱乏一直是影響角膜移植手術實施的主要問題之一。近年來各國研究者們都在努力探尋更加安全、高效的移植材料來緩解角膜供體緊張的局面。目前有研究將聚甲基丙烯酸甲酯和水凝膠等人工合成材料植入角膜基質中進行觀察，但均有中毒性角膜基質炎、植片排出和植片溶解等并發(fā)癥發(fā)生[1-2]，人工合成角膜移植材料還有待改進。目前應用異種生物材料進行角膜移植開始受到關注，但如何有效地通過化學或者物理方法去除移植組織中的細胞成分，同時保持組織的固有結構是目前所面臨的主要難題之一[3]。飛秒激光小切口角膜透鏡取出術(small-incision lenticule extraction，SMILE)代表著當今角膜屈光手術的發(fā)展趨勢，是目前的主流術式之一，其利用飛秒激光精準聚焦定位的立體切割技術在角膜基質層內特定深度中切割出一定大小和厚度的透鏡，從而達到矯正屈光不正的目的。我們前期的研究已證明人角膜基質透鏡在經(jīng)過100 Gy的X射線照射或甘油低溫處理后2周內仍能保持良好的纖維結構，并且通過飛秒激光輔助角膜基質透鏡移植術在動物實驗和臨床研究中取得了良好的效果[4-7]。因此，角膜基質透鏡在眼科學再生領域具有重要的應用潛力，可為角膜基質混濁、老視、圓錐角膜及角膜擴張等患者提供新的治療手段[8]。如何能夠長期有效且簡單地保存角膜基質透鏡仍然是角膜基質透鏡移植術推廣所面臨的主要問題之一[9]。本研究對超低溫環(huán)境下保存不同時間的人角膜基質透鏡組織結構變化和透明性進行觀察，擬尋求一種長期有效且簡單可行的角膜基質透鏡保存方法，為角膜基質透鏡的長期保存及其在眼科疾病治療中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 納入2013—2020年在中山大學中山眼科中心海南眼科醫(yī)院行SMILE的200眼，術中獲取角膜基質透鏡標本共200份。標本來源患者中男59例112眼，女45例88眼；平均年齡(20.87±1.20)歲；術眼等效球鏡度為(3.63±0.68)D。本研究中人體組織樣本使用及研究方案經(jīng)中山大學中山眼科中心海南眼科醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：2013-003)，實驗過程均符合《赫爾辛基宣言》。所有患者知曉手術方法及研究目的，均自愿簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 OCT冷凍切片包埋劑(日本Sakura公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)。Forma902超低溫冰箱(美國GP-ULTS公司)；P330型超微量分光光度計(德國Implen公司)；Axioylan2型倒置光學顯微鏡、LSM880激光掃描共焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；Tecnai G2Spirit Twin透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 方法

1.2.1SMILE手術及角膜基質透鏡標本收集 手術由同一經(jīng)驗豐富的主任醫(yī)師完成。采用VisuMax飛秒激光對屈光不正患者行SMILE，術中行角膜基質內雙層同心圓螺旋式掃描以制作角膜基質透鏡，用分離鏟自開口處分離角膜基質透鏡后表面及前表面，用顯微鑷取出完整角膜基質透鏡，透鏡光學區(qū)直徑為(6.50±0.13)mm，厚度為(65.00±1.58)μm。將角膜基質透鏡置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.2.2角膜基質透鏡透明度檢測 按照角膜基質透鏡保存時間不同分為1個月組、24個月組、60個月組和84個月組，每組50份。按照分組時間點將角膜基質透鏡從-80 ℃超低溫冰箱中取出后平放于96孔板中，在水浴中解凍10 min，加入少量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)完全覆蓋角膜基質透鏡。每組取10片角膜基質透鏡，采用超微量分光光度計檢測角膜基質透鏡透明度，檢測波長為300～800 nm，每個透鏡共連續(xù)檢測10次，每次測定的間隔波長為50 nm，計算每個角膜基質透鏡透光率。將每組透鏡標本平鋪于有黑色E字的白紙上，觀察透過角膜基質透鏡標本顯示E字的清晰度，評估其透明性，并在低倍顯微鏡下觀察每組透鏡標本的透明度和完整性。

1.2.3蘇木精-伊紅染色法觀察角膜基質透鏡的組織形態(tài) 每組取10片角膜基質透鏡，用質量分數(shù)4%多聚甲醛固定，以質量分數(shù)30%蔗糖脫水，常規(guī)OCT混合劑包埋，-20 ℃下冰凍切片機切片，切片厚度7 μm。切片以4%多聚甲醛固定10 min，超純水沖洗2 min，蘇木素染色5 min，自來水沖洗2次，每次5 min；吸干切片上水分，用鹽酸乙醇分化液分化10 s；自來水沖洗2次，每次5 min；伊紅染色液染色1 min；自來水沖洗5 min；封片劑封片。倒置光學顯微鏡下觀察切片組織形態(tài)并拍照。

1.2.4Masson染色法觀察膠原纖維結構 每組取10片角膜基質透鏡，組織固定、脫水、包埋及切片方法同1.2.3。切片以鐵蘇木素染色液染色5 min，自來水沖洗；吸干切片上水分，酸性乙醇分化液分化10 s，水洗；用Masson藍化液返藍5 min，蒸餾水浸洗1 min；麗春紅酸性品紅染色液染色5 min；弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗1 min；弱酸工作液洗1 min，直接置于苯胺藍染色液中染色2 min；弱酸工作液洗1 min；體積分數(shù)95%乙醇快速脫水；無水乙醇脫水3次，每次5 s；二甲苯溶液透明3次，每次1 min；封片劑封片。倒置光學顯微鏡下觀察膠原纖維結構變化并拍照。

1.2.5透射電子顯微鏡下觀察角膜基質透鏡超微結構變化 每組取10片角膜基質透鏡，置于質量分數(shù)2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定24 h，質量分數(shù)1%鋨酸固定2 h，用30%、50%、70%、90%乙醇及90%乙醇與90%丙酮混合液逐級脫水，每次15 min，用Epon812包埋樹脂35 ℃下作用2 h以包埋組織，烤箱聚合后制作成70 nm厚切片，用銅網(wǎng)撈片，醋酸鈾染色15 min，水洗3次，硝酸鉛染15 min，水洗3次。透射電子顯微鏡下觀察切片組織膠原纖維及角膜基質細胞超微結構變化并拍照。

1.2.6TUNEL法檢測角膜基質透鏡基質細胞凋亡 每組取10片角膜基質透鏡，組織固定、脫水、包埋及切片方法同1.2.3。用4%多聚甲醛于15～25 ℃下固定冰凍切片20 min，PBS清洗3次，每次10 min；體積分數(shù)3%雙氧水15～25 ℃下封閉10 min，PBS清洗3次，每次5 min，切片浸入通透液中，2～8 ℃條件下促滲2 min；以脫氧核糖核酸酶I在室溫下處理10 min的切片作為陽性對照，將TdTQ酶和標記液混合(1∶ 9)作為TUNEL反應液，37 ℃濕盒避光孵育1 h，將經(jīng)固定和通透處理的細胞與每孔50 μl的標記液一起孵育，以標記液中無末端轉移酶作為陰性對照。孵育結束后用PBS清洗3次，每次5 min，DAPI染色液染核，室溫下濕盒內避光孵育15 min，用PBS清洗3次，每次3 min，吸干切片水分，封片劑封片；采用激光掃描共焦顯微鏡觀察基質細胞凋亡及細胞核染色情況，基質細胞呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。采用ImageJ圖像分析軟件計算TUNEL陽性細胞數(shù)量。計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

表1 各組角膜基質透鏡透光率比較(mean±SD,%)Table 1 Comparison of transmittance of corneal lenticules among different groups (mean±SD,%)組別樣本量不同波長的透光率300 nm350 nm400 nm450 nm500 nm550 nm600 nm650 nm700 nm750 nm800 nm1個月組1018.52±1.7140.47±2.4351.30±1.4154.20±1.3258.07±1.9264.32±0.8468.47±1.7469.87±1.7674.10±2.3774.57±1.9274.47±2.0224個月組1015.15±1.2635.30±3.3745.50±1.2761.07±2.8651.92±2.6959.35±6.3964.97±0.8168.50±4.3068.60±1.3567.12±5.0467.52±3.5160個月組1025.15±2.9451.70±2.25ab59.62±1.31ab59.02±1.7562.65±5.7972.25±3.7569.82±2.5679.20±3.2779.27±3.7380.97±2.9675.72±1.7584個月組1017.70±6.4247.52±5.93b55.85±3.53b62.01±5.9357.70±1.7563.75±5.0866.22±3.7572.17±8.0170.77±5.0870.05±4.9372.72±4.13F值6.7508.11811.6473.5844.9263.5743.3362.5415.2084.8313.999P值0.0800.0440.0090.3100.1770.3110.3430.4680.1570.1850.262 注:與各自1個月組比較,aP<0.05;與各自24個月組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with respective 1-month group,aP<0.05;compared with respective 24-month group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test)

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗滿足正態(tài)分布者以mean±SD表示，1個月組、24個月組、60個月組和84個月組間計量資料總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布資料以M(Q1，Q3)表示，總體差異比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組角膜基質透鏡透明度比較

4個組角膜基質透鏡低倍顯微鏡下均完整、光滑，未見明顯混濁、碎裂和斑塊，透過角膜基質透鏡的E字均清晰可見(圖1)。在350 nm和400 nm波長處4個組角膜基質透鏡透光率明顯不同，總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=8.118，P=0.044；F=11.647，P=0.009)，其中60個月組角膜基質透鏡透光率高于1個月組，60個月組和84個月組透光率均高于24個月組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。波長450～800 nm范圍內各組間角膜基質透鏡透光率總體比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(表1)。

圖1 各組角膜基質透鏡的大體組織透明度觀察(×10，標尺=2 mm) 各組角膜基質透鏡完整、透明，可清晰透見其下方的字母 A：1個月組 B：24個月組 C：60個月組 D：84個月組Figure 1 Gross observation of corneal stromal lenticules in different groups (×10，bar=2 mm) Corneal stromal lenticules were intact and the ‘E’ under the lenticules was clearly visible in various groups A：1-month group B：24-month group C：60-month group D：84-month group

2.2 各組角膜基質透鏡組織學和膠原纖維形態(tài)比較

Masson染色和蘇木精-伊紅染色結果顯示，1個月組角膜基質透鏡中膠原纖維表面光滑，排列致密整齊，透鏡組織表面完整，結構排列整齊；24個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列稍疏松，可見部分膠原纖維排列紊亂，部分纖維間出現(xiàn)空泡；角膜基質透鏡表面不光滑，透鏡組織增厚，組織間可見大小不一的空泡。60個月組角膜基質透鏡膠原纖維及透鏡組織排列疏松呈網(wǎng)狀，纖維間可見大量空泡，透鏡表面形態(tài)凹凸不平，但組織仍較厚；84個月組角膜基質透鏡中部分膠原纖維脫落，厚度變薄(圖2)。

圖2 各組角膜基質透鏡膠原纖維和組織學形態(tài)表現(xiàn)(×200，標尺=20 μm) 1個月組角膜基質透鏡膠原纖維和透鏡組織結構排列整齊，組織表面光滑(箭頭)；24個月組角膜基質透鏡中部分膠原纖維排列紊亂，組織表面不平(箭頭)，角膜基質透鏡組織中出現(xiàn)空泡(星號)；60個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列明顯疏松呈網(wǎng)狀，透鏡組織中有大量空泡(星號)，組織表面不平(箭頭)；84個月組角膜基質透鏡部分膠原纖維脫落，組織表面不光滑(箭頭)，纖維間空泡變少(星號)，組織變薄Figure 2 Histological examination of corneal stromal lenticules in different groups (×200，bar=20 μm) The collagen fibers of corneal stromal lenticules were neatly arranged and tightly packed and the appearance of the lenticules (arrow) was intact in the 1-month group.The interlayer disorders，vacuoles (star) and uneven surface (arrow) were displayed in the collagen fibers and lenticule tissue in the 24-month group.In the 60-month group，a reticulate structure was found in the collagen fibers and the lenticule tissue，showing loosened structure and more interlayer vacuoles (star) and uneven surface (arrow).In the 84-month group，loss of some collagen fibers and thinning of the stromal lenticules，uneven surface (arrow) and fewer vacuoles (star) were seen

2.3 各組角膜基質透鏡超微結構變化

透射電子顯微鏡下觀察結果顯示，1個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列整齊，角膜基質細胞呈細長梭形，核膜完整，細胞質豐富；24個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列較疏松，但仍整齊，角膜基質細胞的細胞核萎縮變形，核膜不完整；60個月組角膜基質透鏡膠原纖維稀疏，排列不整齊，細胞核進一步萎縮變形；84個月組角膜基質透鏡膠原維排列紊亂，結構疏松，角膜基質細胞皺縮，核膜不完整，核質裂解(圖3)。

圖3 各組角膜基質透鏡超微結構變化 A：1個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列整齊規(guī)則(×5 000，標尺=500 nm) B：24個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列較疏松(×5 000，標尺=500 nm) C：60個月組角膜基質透鏡膠原纖維排列疏松(×5 000，標尺=500 nm) D：84個月組角膜基質透鏡膠原維排列紊亂(×5 000，標尺=500 nm) E：1個月組角膜基質細胞呈長梭形，核膜完整，細胞質豐富(箭頭)(×10 000，標尺=1 μm) F：24個月組角膜基質細胞的細胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜不完整(箭頭)(×10 000，標尺=1 μm) G：60個月組角膜基質細胞萎縮，細胞內結構紊亂(箭頭)(×10 000，標尺=1 μm) H：84個月組角膜基質細胞皺縮，核膜結構不連續(xù)，核質裂解(箭頭)(×10 000，標尺=1 μm)Figure 3 Ultrastructures of corneal stromal lenticules in different groups A：The collagen fibers were arranged neatly and regularly in the 1-month group (×5 000，bar=500 nm) B：The arrangement of collagen fibers in the 24-month group was a little looser but still regular (×5 000，bar=500 nm) C：Irregular and loose arrangement of collagen fibers was displayed in the 60-month group (×5 000，bar=500 nm) D：The collagen arrangement in the 84-month group was disordered (×5 000，bar=500 nm) E：The keratocytes in the 1-month group showed elongated and spindle-shaped，and the nuclear membrane was intact and cytoplasm (arrow) was abundant (×10 000，bar=1 μm) F：The cellular nuclei in the 24-month group became deformed and nuclear membrane (arrow) was intact (×10 000，bar=1 μm) G：The cells (arrow) were atrophied and deformed in the 60-month group (×10 000，bar=1 μm) H：The corneal stromal cells (arrow) were wrinkled and atrophied with discontinuous nuclear membrane and lysed nucleoplasm in the 84-month group (×10 000，bar=1 μm)

2.4 各組角膜基質透鏡中基質細胞凋亡率比較

TUNEL染色結果顯示，1個月組、24個月組和60個月組角膜基質細胞熒光強度接近，84個月組TUNEL陽性細胞稍增多。1個月組、24個月組、60個月組和84個月組細胞凋亡率分別為(87.80±1.17)%、(89.50±1.05)%、(89.30±1.51)%和(90.20±1.47)%，各組間總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=4.525，P=0.053)(圖4)。

圖4 各組角膜基質透鏡中TUNEL陽性細胞比較(×200，標尺=20 μm) 細胞核呈藍色熒光(DAPI)，TUNEL陽性細胞為紅色熒光(DAB)。84個月組TUNEL陽性細胞稍增多 DAPI：4’，6-二脒基-2-苯基吲哚；TUNEL：DNA末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法Figure 4 Comparison of TUNEL-positive cells in corneal stromal lenticules among various groups (×200，bar=20 μm) Cellular nuclei showed blue fluorescence (DAPI) and TUNEL-positive cells showed red fluorescence (DAB).The TUNEL-positive cells were slightly increased in the 84-month group DAPI：4’，6-diamidino-2-phenylindole;TUNEL:TdT-mediated biotinylated-dUTP nick-end labeling

3 討論

SMILE手術中取出的健康生物材料“角膜基質透鏡”是位于角膜中央?yún)^(qū)基質前層的膠原纖維組織。由于角膜的硬度主要來自膠原纖維層，角膜基質層厚度與角膜硬度呈正相關，因此膠原纖維層對維持角膜的生物力學特性起著主導作用[10]，角膜基質透鏡應用研究為眼科部分疾病的治療拓展了新的途徑[5,11-12]。

角膜基質透鏡的臨床應用面臨的主要挑戰(zhàn)之一是找到簡單、經(jīng)濟且能長期保存角膜基質透鏡的有效方法，使之能夠廣泛用于藥物載體研究、生物移植材料和眼科疾病的手術治療[8-9,13]。目前的相關研究主要集中在不同保存液對角膜基質透鏡的中短期保存方面，Liang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下短期保存(1～14 d)的角膜基質透鏡在Optisol角膜保存液中細胞結構變化較慢。Yam等[15]研究認為，在21周內經(jīng)過質量分數(shù)0.1%十二烷基硫酸鈉處理后的角膜基質透鏡仍能保持穩(wěn)定的光學特性。然而，Optisol角膜保存液及其他保存液均存在有效期較短且費用較高，不適合長期使用的問題。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用不同保存液在4 ℃或室溫下(約20 ℃)保存48 h可有效維持角膜基質透鏡的透明度、完整性和低免疫原性，這為新鮮角膜基質透鏡的轉運和定點保存提供了方法學依據(jù)。

甘油保存法是目前應用較廣的長期保存角膜的方法之一。Liang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，無水甘油或硅膠干燥劑保存的角膜基質透鏡更易出現(xiàn)細胞破壞和水腫。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，-20 ℃低溫下甘油保存3個月角膜基質透鏡中大量膠原纖維斷裂且結構排列紊亂，與其他研究結果相似[14,17]，因此用甘油長期保存角膜基質透鏡具有一定的限制性。超低溫保存法是一種長期保存生物組織的方法，也可用于角膜的保存，但存在角膜內皮損傷的缺點，因此很少用于角膜長期保存[18-19]。角膜基質透鏡主要由Ⅰ型和Ⅴ型膠原纖維構成，保存時除要保持基質透鏡的完整性和透明度外，無需維持角膜內皮的生存和完整性，也可避免后彈力層皺褶帶來的影響，因此超低溫技術保存角膜基質透鏡具有一定的應用前景。本研究發(fā)現(xiàn)，-80 ℃環(huán)境下長期保存的角膜基質透鏡組織未見混濁、碎裂和斑塊，450～800 nm波長范圍內保存不同時間組的透鏡透光率接近，但350～400 nm波長范圍內4個組的透鏡透光率有較大差異，與Yam等[15]的研究結果近似。因450～800 nm為可見光，而350～400 nm為紫外光，紫外光比可見光具有更高的能量，70%～75%的紫外光由角膜基質層吸收[20-21]，推測保存60個月的角膜基質透鏡中含水量增多和膠原纖維排列紊亂是導致這種差異的原因。

規(guī)則的膠原纖維排列是保持角膜透明性的必要條件之一[22]。本研究中對角膜基質透鏡的組織形態(tài)學和超微結構進行觀察，發(fā)現(xiàn)與保存1個月相比，保存24個月的角膜基質透鏡開始出現(xiàn)部分膠原纖維結構排列稍疏松，纖維間出現(xiàn)空泡，保存60個月膠原纖維排列疏松，部分膠原纖維排列不規(guī)則，空泡增多，保存84個月膠原纖維排列紊亂，組織松散脫落。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人角膜基質透鏡可經(jīng)冷凍技術保存，雖然隨著保存時間的延長細胞凋亡率較高，但是對角膜基質透鏡的透明性及其在一些疾病治療中的臨床應用的影響不大。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然角膜基質透鏡在超低溫環(huán)境下保存時間超過60個月會出現(xiàn)明顯的組織結構變化，但其透明度和完整性仍良好，這為保存的角膜基質透鏡作為角膜移植材料提供了依據(jù)，即超低溫保存技術長期保存角膜基質透鏡有效且簡單可行。Rovere等[23]研究發(fā)現(xiàn)，超低溫保存可降低主要組織相容性復合體的表達，減少術后免疫排斥反應。我們推測角膜基質透鏡在超低溫環(huán)境下長期保存后會形成低免疫原性角膜基質支架，當受體角膜內皮細胞能夠維持正常的屏障功能和離子泵作用時，即可減輕術后角膜水腫，保持角膜的透明性。我們認為保存時間>60個月的角膜基質透鏡可用于蠶食性角膜潰瘍等免疫性角膜疾病的手術治療，保存時間<24個月的角膜基質透鏡適合于角膜基質混濁、老視和圓錐角膜等的手術治療。

本實驗尚未明確角膜基質透鏡膠原纖維結構發(fā)生變化的時間點，也缺乏長期保存角膜基質透鏡用于臨床治療的研究證據(jù)。本課題組根據(jù)本研究結果已將各組角膜基質透鏡分別建立角膜移植動物模型，并對移植受體角膜的各項生理指標和生物力學特性進行監(jiān)測，以進一步明確角膜基質透鏡膠原纖維結構發(fā)生變化的時間點，為超低溫保存下角膜基質透鏡治療角膜基質混濁、老視和圓錐角膜等疾病的研究提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突