可用于現(xiàn)場快速檢測的小型化多通道光譜測量系統(tǒng)

簡 丹，劉 誠,2

（1.江南大學 理學院，江蘇 無錫 214122；2.中國科學院上海光學精密機械研究所，上海 201800）

引言

生化傳感技術(shù)可以對特定的生物化學被測物進行識別、測量與分析，是目前生物學和醫(yī)學研究中最為常用的工具。多數(shù)生化傳感技術(shù)都是將被測樣品的性質(zhì)（如含量、結(jié)構(gòu)等）轉(zhuǎn)化為可以直接測量的物理量，其覆蓋力學、熱學、聲學、電學和光學參量等[1-7]。由于光學參量測量具有非接觸、低損傷和易測量等優(yōu)點，并且可以通過測量包括強度、相位、偏振、光譜[8-10]等多維度信息實現(xiàn)樣品多參數(shù)檢測，因此基于光學參數(shù)測量的各類生化傳感器獲得了更多的應(yīng)用。其中，包括吸收光譜[11-13]、熒光光譜[14-15]和拉曼光譜[16-17]的各類光譜檢測技術(shù)是生化傳感中的重要手段。在各類光譜應(yīng)用中，其與酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）的結(jié)合是最為常見的應(yīng)用之一[18-19]。雖然傳統(tǒng)的光譜儀能夠以極高的分辨率實現(xiàn)對特定光譜的測量與分析，但是也存在系統(tǒng)復雜、價格昂貴等諸多缺點，導致其只適用于實驗室檢測，并不是現(xiàn)場快速檢測的首選工具。

小型化光譜儀是實現(xiàn)現(xiàn)場光譜檢測的理想工具。商業(yè)化和準商業(yè)化的小型化光譜儀主要有美國德州儀器公司設(shè)計的基于數(shù)字微鏡陣列的光譜儀[20]以及日本濱松光子[21]開發(fā)的芯片式光譜儀，但是前者價格昂貴，而后者難以和現(xiàn)有生化檢測系統(tǒng)相結(jié)合。為了實現(xiàn)低成本的生化檢測，美國加州大學洛杉磯分校OZCAN 研究組提出了基于光纖束的智能手機ELISA 測量系統(tǒng)[22]，其不僅成本可控，而且可以直接對96 孔板中的大量樣品進行高通量測量；但是該系統(tǒng)只能對特定波長信號進行測量與分析。美國伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校CUNNINGHAM 研究組[23]，華盛頓州立大學LI 研究組[24]和賓夕法尼亞州立大學LIU 研究組[25]分別設(shè)計了基于光柵的小型化智能手機光譜儀，可以覆蓋全可見光光譜，并成功對胎兒纖維蛋白、氧磷、牛血清蛋白等生物樣品進行了檢測。另外，本課題組還設(shè)計了基于太陽光的小型化智能手機光譜儀[26]，實現(xiàn)了包括豬圓環(huán)病毒抗體和禽流感病毒抗體的測量。雖然這些基于智能手機的小型化光譜儀體積小巧、價格可控，能夠用于現(xiàn)場光譜檢測應(yīng)用中，但是也存在檢測通量低、探測器性能不穩(wěn)定等缺陷。

為了滿足高通量、高光譜分辨率和價格可控的現(xiàn)場光譜測量應(yīng)用需求，本文設(shè)計了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)，其尺寸緊湊僅為118 mm×94 mm×100 mm，且價格可控；但是仍舊具有極高的光譜分辨率和測量精度。另外，該系統(tǒng)設(shè)計了多通道光譜測量結(jié)構(gòu)，能夠同時檢測多個樣品從而有效提高了測量通量。通過對標準樣品（羅丹明6G）和實際樣品（禽流感病毒抗體）的測量證明了本文設(shè)計的小型化多通道光譜測量系統(tǒng)可以實現(xiàn)各類目標物的準確定量檢測。因此，本文設(shè)計的小型化多通道光譜測量系統(tǒng)有望成為現(xiàn)場光譜測量的理想工具。

1 系統(tǒng)構(gòu)建與光譜標定

圖1（a）展示了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

圖1 小型化多通道光譜測量系統(tǒng)Fig.1 Portable multi-channel spectral measurement system

寬譜光源由白光LED 提供，雖然相較于商業(yè)光譜儀中常用的高壓汞燈，其光譜均勻度并不理想，但是LED 體積小巧，對電源要求低，更適用于小型化光譜儀的結(jié)構(gòu)設(shè)計。另外，在實際測量中，用于后期處理和分析的光譜數(shù)據(jù)實際上是樣品透射光譜和背景光譜的比值，該操作步驟能夠有效補償LED 非均勻光譜的影響。待探測光透過比色皿（7.5 mm×7.5 mm×10 mm）后，使用一成像透鏡（直徑10 mm，焦距30 mm，大恒光電，中國）將其聚焦并使用100 μm 小孔進行濾波，最后再使用一成像透鏡（直徑10 mm，焦距30 mm，大恒光電，中國）將光束匯聚至光柵（1200 線/mm，Thorlabs，美國）表面用于色散分光。使用兩組透鏡的原因是該設(shè)計結(jié)合小孔濾波不僅可以提高光譜分辨率，而且較直接透過小孔或者狹縫的方式，還可以提高光的利用率。

此外，為了實現(xiàn)高通量光譜測量，小型化多通道光譜測量系統(tǒng)包含了如圖1（a）所示的三路光譜測量結(jié)構(gòu)，其光譜均由單個光柵色散后使用同一CCD 圖像傳感器（Allied Vision Pike421B，德國）接收?？紤]到使用的圖像傳感器的靶面大小以及光學系統(tǒng)的體積，這里僅構(gòu)建了三通道結(jié)構(gòu)；但是如果進一步增大探測器的靶面，并選擇更為緊湊的光譜測量結(jié)構(gòu)，通道數(shù)還能夠進一步提高。裝調(diào)光路和設(shè)計光路之間存在的誤差可能會導致光譜成像的畸變，因此在系統(tǒng)裝調(diào)中需要確保光路光軸的一致性。雖然卡槽的結(jié)構(gòu)設(shè)計可以將光學元件排布成等距陣列并固定，極大的減少了光學元件間距對光譜位置分布造成影響，但是在裝配過程中可能存在裝調(diào)傾斜，依舊會導致光譜位置分布不均勻，因此在裝調(diào)過程中需要保證LED 燈珠的入射光角度以及透鏡的中心軸不存在傾斜和偏轉(zhuǎn)。當CCD 圖像傳感器上光譜的成像間隔和所設(shè)計的透鏡中心位置的間距一致時表明系統(tǒng)裝調(diào)達到標準。使用3D 打印結(jié)構(gòu)將光源、樣品槽、透鏡、小孔、光柵以及CCD 圖像傳感器集成，小型化多通道光譜測量系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)的尺寸為118 mm3×94 mm3×100 mm3。

另外，為了在終端上直接控制白光LED 和圖像傳感器以實現(xiàn)自動光譜測量，本文還為小型化多通道光譜測量系統(tǒng)設(shè)計了軟件，如圖1（b）所示。首先，該軟件通過串口繼電器實現(xiàn)白光LED的控制，而CCD 圖像傳感器通過USB 與單板計算機的連接以完成光譜圖像拍攝和傳輸。之后，該軟件通過抽取多行像素值進行平均獲得各個通道的像素點-光譜強度對應(yīng)關(guān)系。最后，根據(jù)預先標定的各個通道的像素點-波長對應(yīng)關(guān)系，重建光譜以精確獲得可見光范圍內(nèi)各個波長對應(yīng)的強度分布。

為了標定各個通道的像素點-波長對應(yīng)關(guān)系，將白光LED 換成450 nm、532 nm 和650 nm 的激光器，并提取各通道對應(yīng)的像素點-光譜強度對應(yīng)關(guān)系，如圖2（a）所示，其中光譜強度的峰值位置對應(yīng)了各個激光波長。隨后，將激光波長與其對應(yīng)的像素位置作直線擬合，即可確定各通道像素點-波長對應(yīng)關(guān)系，如圖2（b）所示。擬合直線的R2都極接近1，證明各通道的像素點-波長對應(yīng)關(guān)系具有良好的線性。另外，3 個通道擬合直線的斜率分別為7.54，8.05 和7.34，其倒數(shù)是對應(yīng)的光譜分辨率，分別為0.133 nm/pixel，0.124 nm/pixel 和0.136 nm/pixel，物理含義是每個像素點代表的光譜波長寬度。可以看出3 個通道都具有極高的光譜分辨率，從而能夠滿足光譜測量應(yīng)用的需求。根據(jù)各個通道標定的像素點-波長對應(yīng)關(guān)系，可將圖2（a）所示的像素點-光譜強度對應(yīng)關(guān)系重建為激光器的光譜信息，如圖2（c）所示。3 個通道的激光器光譜分布吻合較好，證明了像素點-波長對應(yīng)關(guān)系的準確標定。雖然使用更多不同波長的激光器用于標定，并使其波長更為全面地覆蓋可見光波段，則擬合獲得的像素點-波長對應(yīng)關(guān)系更為準確；但是過多的激光也會導致標定過程更為復雜。因此，這里僅選擇了3 種不同波長的激光，且盡可能覆蓋了可見光波段，同時保證了標定的準確性和便捷性。

在系統(tǒng)構(gòu)建和光譜標定的基礎(chǔ)上，將小型化多通道光譜測量系統(tǒng)用于代表標準樣品的羅丹明6G 和代表實際樣品的禽流感病毒抗體的檢測，以評估本文提出的小型化多通道光譜測量系統(tǒng)在現(xiàn)場光譜測量應(yīng)用中的可行性。

2 實驗結(jié)果與討論

在對實際樣品測量之前，首先使用小型化多通道光譜測量系統(tǒng)對鹵素燈和白光LED 光譜進行了測量以評估其光譜測量準確性。首先使用小型化多通道光譜測量系統(tǒng)對鹵素燈的光譜進行了測量。圖3（a）中實線表示各通道對同一鹵素燈的光譜測量結(jié)果，一致的光譜測量結(jié)果表明小型化多通道光譜測量系統(tǒng)各通道裝調(diào)的均一性。之后，對系統(tǒng)各通道內(nèi)置白光LED 的光譜進行測量，圖3（b）中的實線展示了各通道白光LED 的光譜，其光譜形貌較為一致，說明了使用的白光LED 質(zhì)量較為均一。為了驗證小型化多通道光譜測量系統(tǒng)光譜測量的準確性，還使用了商業(yè)化的光纖光譜儀（復享光學，中國）對鹵素燈和白光LED 的光譜進行了測量，測量結(jié)果如圖3（a）和（b）虛線所示，實驗結(jié)果說明小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的光譜測量結(jié)果與商業(yè)光譜儀吻合較好，證明了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)可以實現(xiàn)對多個樣品進行準確的光譜測量。

圖3 小型化多通道光譜測量系統(tǒng)光譜測量驗證Fig.3 Spectral measurement verification on portable multichannel spectral measurement system

在確定該小型化多通道光譜測量系統(tǒng)光譜測量準確性的基礎(chǔ)上，首先使用該系統(tǒng)對標準樣品進行了測量。這里使用已知濃度的羅丹明6G 溶液作為標準樣品，其濃度分別為2 μg/mL，4 μg/mL，6 μg/mL，8 μg/mL 和10 μg/mL。將一系列溶液放置于比色皿中，并使用小型化多通道光譜測量系統(tǒng)測量其光譜以獲得對應(yīng)的吸收譜線，如圖4（a）所示。值得說明的是，在每一次測量中，各通道的比色皿上均放置同一濃度的羅丹明6G 溶液，因此圖4（a）所示的吸收譜線實際上是各通道的測量結(jié)果（不同通道對應(yīng)不同的線型）。對于同一濃度的羅丹明6G 溶液，各通道吸收譜線基本一致，而且在520 nm 處的吸收峰明顯與羅丹明6G 濃度有關(guān)。圖4（b）擬合了羅丹明6G 濃度與520 nm 處吸光度（OD520）的關(guān)系：3 條擬合直線的R2分別為0.998，0.996 和0.998，證明羅丹明6G 溶液濃度與OD520 之間滿足線性關(guān)系；此外，3 條擬合直線非常接近，也證明了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)具有很好的測量準確性和通道均一性。

圖4 不同濃度羅丹明6G 溶液對應(yīng)的吸收譜及其濃度與OD520 的直線擬合關(guān)系Fig.4 Absorption spectrum of Rhodamine 6G solutions in different concentrations and linear fitted relation between solutions concentration and OD520

最后使用禽流感H7N9 病毒抗體作為樣品，使用小型化多通道光譜測量系統(tǒng)實現(xiàn)抗體稀釋度的定量測量。為了制備禽流感H7N9 抗體，首先在每個微孔板的反應(yīng)孔中添加蛋白包被液，并使用碳酸鹽緩沖液配制質(zhì)量分數(shù)為5%的牛血清白蛋白封閉液封閉；然后使用0.01 M 的磷酸鹽緩沖液將H7N9 的抗體分別 稀 釋103，5×103，104，5×104，105，3×105，5×105，8×105和106倍以獲得不同濃度的待測樣品；隨后加入0.1 mL 磷酸鹽緩沖液稀釋的酶標抗體（HAb1）；最后加入TMB 底物顯色液并引入50 μL 濃度為2 M 硫酸以終止酶促反應(yīng)。

為了實現(xiàn)抗體稀釋度的定量測量，首先需要確定其與OD450 的關(guān)系。圖5（a）和5（b）分別展示了使用小型化多通道光譜測量系統(tǒng)和商業(yè)酶標儀（Tecan，瑞士）的測量結(jié)果。圖5（a）中實線、虛線和點線分別代表各通道測量得到的結(jié)果：吸收譜較為吻合且與商業(yè)酶標儀測量結(jié)果一致，證明了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的準確性。在此基礎(chǔ)上，可以從圖5（a）和5（b）中提取抗體稀釋度與OD450 的關(guān)系。圖5（c）展示了由小型化多通道光譜測量系統(tǒng)獲得的抗體稀釋度與OD450 的關(guān)系，該系統(tǒng)的測量范圍為103～3×105：當禽流感H7N9病毒抗體稀釋倍率達到檢測下限時，對應(yīng)的OD450值與去離子水的OD450 值已沒有明顯區(qū)別；而當稀釋倍率達到檢測上限時，其OD450 值已經(jīng)接近1，無法測量濃度高于檢測上限的抗體樣品。圖5（d）展示了商業(yè)酶標儀的測量結(jié)果，該系統(tǒng)的測量范圍為103～8×105，與小型化多通道光譜測量系統(tǒng)相比，其檢測上限一致，但是下限更低，但是仍舊處于同一數(shù)量級。此外，圖5（c）和5（d）中插入圖展示了OD450 與稀釋度對數(shù)間的線性關(guān)系：小型化多通道光譜測量系統(tǒng)各通道R2分別0.970，0.951和0.973，較高的線性度保證了適用范圍內(nèi)樣品稀釋度的準確測量。

圖5 小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的實際應(yīng)用Fig.5 Practical application of portable multi-channel spectral measurement system

最后，為了驗證小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的通道一致性，圖5（e）展示了當樣品稀釋度為103，104和5×104時各通道測量獲得的OD450 值，各通道測量結(jié)果極為相近證明了在不同稀釋度情況下，小型化多通道光譜測量系統(tǒng)各通道均能夠穩(wěn)定準確地實現(xiàn)樣品稀釋度的定量測量。此外，為了驗證小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的測量準確性，圖5（f）展示了當樣品稀釋度為5×104時小型化多通道光譜測量系統(tǒng)各通道和商業(yè)酶標儀測量獲得的OD450 值，測量結(jié)果一致證明了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)的準確性。作為一種通用檢測平臺，小型化多通道光譜測量系統(tǒng)可以對各類樣品實現(xiàn)準確、快速、穩(wěn)定的光譜測量與分析。

雖然該小型化多通道光譜測量系統(tǒng)可以實現(xiàn)樣品快速、準確和多通道檢測，而且具有光譜分辨率高和系統(tǒng)緊湊等優(yōu)勢，因此適用于現(xiàn)場檢測應(yīng)用中；但是該系統(tǒng)仍舊存在不足。首先，本工作設(shè)計的系統(tǒng)支持樣品多通道同時測量，然而更多的通道數(shù)量需要更大尺寸的光學元件和更大靶面的圖像傳感器，不可避免的增加了系統(tǒng)的成本。根據(jù)圖像傳感器靶面以及常用光學元件尺寸，本文設(shè)計的結(jié)構(gòu)采用三通道設(shè)計，一方面比單通道系統(tǒng)具有更高的檢測效率，另外也盡可能降低了系統(tǒng)成本和復雜性。其次，光學元件的缺陷和系統(tǒng)裝調(diào)的誤差不可避免會導致光譜測量誤差。為了精確確定各通道像素點-波長對應(yīng)關(guān)系，應(yīng)使用已知光譜的定標燈對系統(tǒng)進行定標和驗證。本工作使用了多種波長的激光對系統(tǒng)進行了標定，其定標結(jié)果也足以保證準確的光譜測量。最后，雖然本工作已將該小型化多通道光譜測量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)化，但是圖像傳感器仍舊需要外接電源，限制了系統(tǒng)的便攜性。因此，在該系統(tǒng)的未來優(yōu)化中，可以考慮增加內(nèi)置電源，以保證該系統(tǒng)在無外部供電的情況下依然能夠進行現(xiàn)場光譜測量。

3 結(jié)論

本文設(shè)計并構(gòu)建了可用于現(xiàn)場快速檢測的小型化多通道光譜測量系統(tǒng)，其不僅具有較高的光譜分辨率，能夠滿足高精度光譜測量的需求，而且多通道設(shè)計可以同時對多個樣品進行檢測以提高檢測通量。另外，該系統(tǒng)尺寸僅為118 mm3×94 mm3×100 mm3，便于攜帶，并且具有獨立的軟件系統(tǒng)，能夠支持現(xiàn)場測量。使用羅丹明6G 作為標準樣品驗證了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)具有較高的測量精度，另外使用禽流感病毒H7N9 抗體作為實際樣品證明了小型化多通道光譜測量系統(tǒng)成功應(yīng)用于目標物的準確測量。由于該小型化多通道光譜測量系統(tǒng)具有靈敏度好、分辨率高、測量準確、操作便捷、體積小巧等諸多優(yōu)點，可以實現(xiàn)各類目標物的準確定量測量，從而有望用于各類現(xiàn)場快速光譜檢測應(yīng)用中。