HPLC-ELSD法測定注射用阿奇霉素含量及有關(guān)物質(zhì)

＊王殿奎 李婷 范桂強(qiáng)

（衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 河北 053000）

阿奇霉素一種半合成的十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素，呈白色粉末或者晶體，具有吸收效果好，生物利用高、副作用低、抗菌范圍廣等效果。在食入時(shí)無異味，偏苦，有輕微的引濕性。在臨床上主要用于治療呼吸道、支氣管炎、皮膚軟組織感染以及尿道炎等等。根據(jù)相關(guān)資料顯示：注射阿奇霉素可以有效抑制細(xì)菌的轉(zhuǎn)肽，抑制蛋白質(zhì)的合成，抗菌效果好。不同的藥物搭配阿奇霉素有不同的治療效果，若使用藥物超標(biāo)導(dǎo)致出現(xiàn)不良反應(yīng)應(yīng)及時(shí)根據(jù)患者的病情采取有效的治療措施。根據(jù)有關(guān)注射用阿奇霉素用量分析等相關(guān)知識，按照《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》測定其含量等，影響因素較多、手續(xù)較復(fù)雜。相關(guān)報(bào)道表示：采用HPLC-UV法測定注射用阿奇霉素含量及有關(guān)物質(zhì)，手續(xù)簡單方便、專業(yè)性強(qiáng)，但因?yàn)榘⑵婷顾刂辉谀┒诉M(jìn)行吸收，而大大降低該方法的準(zhǔn)確度[1]。為了進(jìn)一步控制阿奇霉素含量以及有關(guān)物質(zhì)的檢測，本實(shí)驗(yàn)展開HPLC-ELSD法測定注射用阿奇霉素含量及有關(guān)物質(zhì)的研究分析，具體報(bào)告如下：

1.資料與方法

(1)儀器與試劑

儀器設(shè)備選擇Agilent 1200安捷倫的高效液相色譜儀（生產(chǎn)企業(yè)：南京利爾實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司，型號：1200）；其中包括脫氣機(jī)（綿陽世諾科技有限公司）；智能進(jìn)樣器（鄭州安諾科學(xué)儀器有限公司）；柱溫箱（生產(chǎn)企業(yè)：大連依利分析儀器有限公司，型號：ZW1201）；四元梯度泵（生產(chǎn)企業(yè)：天津琛航科苑科技發(fā)展有限公司，型號：Q-Grad）等。檢測器可使用美國SofTA公司生產(chǎn)的Model300sELSD型；選擇上海精密儀器儀表有限公司生產(chǎn)的pH計(jì)酸度計(jì)；電子天平（生產(chǎn)企業(yè)：上海精天電子儀器有限公司，型號：NDJ-1C）；超聲波清洗器（生產(chǎn)企業(yè)：北京眾益中和生物技術(shù)有限公司，型號：QL-100S）；智能溶出儀（生產(chǎn)企業(yè)：天津諾雷信達(dá)科技有限公司，型號：ZRS-3ST）。

(2)試藥與試劑

藥物選取：阿奇霉素對照品（生產(chǎn)企業(yè)：上海廣銳生物科技有限公司，型號：ZRS-3ST）；阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)企業(yè)：深圳生物科技有限公司，CAS型號：117772-70-0）；注射用阿奇霉素、乙腈、三蒸水以及其他試劑均為分析純。

(3)溶液的制備

①對照品溶液：在準(zhǔn)確的精密度下選取適量的阿奇霉素對照品，放于50ml的容器內(nèi)加入適當(dāng)數(shù)量稀釋液，使用超聲進(jìn)行溶解，后使用稀釋液進(jìn)行定容，溶度為0.5mg/ml。將制作完成的對照品材料放置專門儲存的器材內(nèi)，精密量在對照品儲備液中的5ml，將以上放置在與20ml的容器內(nèi)，使用加上稀釋液溶解、稀釋、搖勻均勻即可[2]。

②在準(zhǔn)確精密度下選取適量的阿奇霉素，放于100ml的容器內(nèi)，采用超聲進(jìn)行溶解，選取適當(dāng)數(shù)量稀釋液，后使用稀釋液進(jìn)行定容，溶度為0.5mg/ml。將制作完成的對照品材料放置專門的供試品儲存的器材內(nèi)，精密量在對照品儲備液中的5ml，將以上放置在與20ml的容器內(nèi)，使用加上稀釋液溶解、稀釋、搖勻均勻即可。

③在精密稱取下使用適量注射用阿奇霉素，放于100ml的容器內(nèi)，采用超聲進(jìn)行溶解，選取適當(dāng)數(shù)量稀釋液，后使用稀釋液進(jìn)行定容。制作成溶度約7.5mg/ml的溶液[3]。

2.方法與結(jié)果

(1)色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜為Boston pHIex-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為0.03mol/L乙酸銨-乙腈。柱溫箱溫度為40℃；漂移管溫度為60℃，以空氣載氣，氣壓為50psi。在符合色譜條件下進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，阿奇霉素的理論塔板數(shù)計(jì)算值將高于4000。

(2)專屬性實(shí)驗(yàn)

在準(zhǔn)確的精密度下選取適量的阿奇霉素對照品，將樣品分為4份。取1份樣品加入，5ml稀釋液溶解，加入1mol/L的鹽酸，在室內(nèi)放60min后加入1mol/L的氫氧化鈉混合稀釋、搖勻后稀釋到25ml，作為酸降解產(chǎn)物；5ml稀釋液溶解，加入1mol/L氫氧化鈉，在水浴內(nèi)放置20min后，取出冷卻。后加入1mol/L的鹽酸，稀釋到25ml后作為堿降解產(chǎn)物；5ml稀釋液溶解，加入30%的過氧化氫，在室內(nèi)放60min加入稀釋液稀釋到25ml后作為氧化降解產(chǎn)物；在130℃的高溫破壞60min。液稀釋到25ml后作為高溫破壞降解產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：阿奇霉素和酸降解產(chǎn)物、堿降解產(chǎn)物、氧化降解產(chǎn)物以及高溫破壞降解產(chǎn)物所出現(xiàn)的降解產(chǎn)物可以很好的進(jìn)行分離、分解，降解產(chǎn)物以及主成分自己的鑒定不出現(xiàn)混淆，擾亂等情況。通過此實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)：該方法的專屬性良好。

(3)線性關(guān)系考察

在準(zhǔn)確的精密度下根據(jù)：“1.3.1”的對照品儲存液中的0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.5ml以及5.0ml的容器分別放于10ml的容器瓶內(nèi)，加入稀釋液進(jìn)行搖晃均勻，制作成對照品溶液。面積以峰表示，常用對數(shù)（lgY）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量的常用對數(shù)以（lgX）作為橫坐標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)過程中需繪制出精準(zhǔn)的曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸方程：lgY=1.3095lgX＋2.85933r=0.9995。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：阿奇霉素在0.51124-5.10229ug的范圍內(nèi)表示其內(nèi)線性的關(guān)系優(yōu)好。

(4)采取以自身進(jìn)行對比法

選擇在準(zhǔn)確的精密度下的相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測試的供試品溶液中的0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.5ml以及5.0ml的容器分別放于100ml的容器瓶內(nèi)，使用稀釋液進(jìn)行搖晃均勻得到供試品的0.5%、1.0%、1.5%、2.5%以及4.0%的對照品溶液。在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行色譜圖繪制來記錄。面積以峰表示，常用對數(shù)（lgY）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量的常用對數(shù)以（lgX）作為橫坐標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)過程中需繪制出精準(zhǔn)的曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸方程：lgY=1.2396lgX＋2.8194r=0.9997。

根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相關(guān)物質(zhì)在進(jìn)行檢測時(shí)在0.7509-6.5989ug的范圍內(nèi)表示峰面積的對數(shù)與樣品原本的溶度相比，質(zhì)量對數(shù)顯示有良好的線性關(guān)系。

(5)重復(fù)性分析

在準(zhǔn)確的精密度下與選擇6份相同編號的樣品，根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)方式制作成供試品溶液，后進(jìn)行色譜圖記錄以及分析，可得出結(jié)果：阿奇霉素的平均含量在標(biāo)識量的99.4%左右。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性完全符合要求。

3.討論

（1）流動(dòng)相的選擇：選擇美國SofTA公司生產(chǎn)的Mode l300sELSD型檢測器進(jìn)行質(zhì)量檢測，在相對的測定條件下通過漂移管為蒸發(fā)完成的氣體、固體或者顆粒都會(huì)出現(xiàn)相對的反應(yīng)。在持續(xù)性下通過漂移管的流動(dòng)相來全部揮發(fā)，主要揮發(fā)化合物的溶劑或者改性劑。在本實(shí)驗(yàn)過程中流動(dòng)相為0.03mol/L乙酸銨-乙腈。柱溫箱溫度于40℃；漂移管溫度為60℃，以空氣載氣，氣壓為50psi。結(jié)果中阿奇霉素的峰型良好，保持時(shí)間合理，分離效果也非常好[4]。

（2）有關(guān)物質(zhì)的測定：因?yàn)榘⑵婷顾氐南嚓P(guān)雜質(zhì)無法直接獲得，因此本文選擇采用自身對照法進(jìn)行測定，注射用阿奇霉素中存在的保留時(shí)間較小的雜質(zhì)量也在1.0%以下，對于保存時(shí)間較長的雜質(zhì)量在0.5%以下，雜質(zhì)的總數(shù)量小于1.5%。

（3）色譜柱的選擇：阿奇霉素是堿性藥物，流動(dòng)相所要求的pH值較高，對色譜柱具有一定的損壞性。本次實(shí)驗(yàn)選擇Boston pHIex-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，其pH值的可承受范圍較大（為1.0～12.0），具有耐堿性，分離的重現(xiàn)性良好。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)方法簡單方便、操作手續(xù)輕松并且準(zhǔn)確可靠，運(yùn)用測定注射用阿奇霉素含量及有關(guān)物質(zhì)以及質(zhì)量控制，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，值得推廣。