多重PCR與恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在呼吸道病原體中的檢測(cè)價(jià)值

邸紅芹 安曉穎 張輝 高艷君 陳寧 劉戰(zhàn)地

呼吸道感染是常見多發(fā)流行病，具有來源復(fù)雜，感染力強(qiáng)，感染發(fā)病急，潛伏期短，傳播快等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生活質(zhì)量。不同的呼吸道病原體感染，其臨床癥狀極為相似，尤其是在不明原因呼吸道疾病爆發(fā)時(shí)，有效、快速的鑒別患者感染呼吸道病原體的類型對(duì)臨床早期診斷和治療至關(guān)重要。傳統(tǒng)的呼吸道病原體檢測(cè)方法主要是細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，由于其操作復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度低且檢測(cè)時(shí)間長無法滿足快速診斷的要求。近年來分子生物學(xué)技術(shù)以其高敏感度、高特異度且操作快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為快速診斷呼吸道病原體的首選方法[1-3]，且多重病原體檢測(cè)系統(tǒng)也越來越普及，博奧生物呼吸道病原菌核酸檢測(cè)為國內(nèi)運(yùn)用較多的呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒，是一種基于恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片技術(shù)，利用鏈置酶(Bst酶)在恒溫(65℃)條件下進(jìn)行反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光分析，一步完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增和檢測(cè)，簡單易行[4]。本研究采用多重PCR檢測(cè)體系[5]和恒溫芯片法檢測(cè)呼吸道病原體核酸，比較兩種方法對(duì)呼吸道病原體的檢測(cè)效能，評(píng)估多重PCR體系在呼吸道病原體診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2017年1月至2017年5月診斷為下呼吸道感染或肺炎的新入院患者，符合以下癥狀：出現(xiàn)咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出現(xiàn)濕啰音并伴有發(fā)熱或白細(xì)胞總數(shù)和嗜中性粒細(xì)胞比例增高等。共收集合格痰液標(biāo)本123例，其中男81例，女42例；年齡16～88歲，平均年齡(49.55±6.51)歲。痰合格標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞數(shù)>25/低倍視野且上皮細(xì)胞<10/低倍視野，樣本量≤0.6 ml，置于樣本收集管內(nèi)，立即保存于4℃冰箱，24 h內(nèi)檢測(cè)，未及時(shí)檢測(cè)的樣本于-70℃冰箱保存。

1.2 試劑和儀器 Ⅱ級(jí)生物安全柜(esco，型號(hào)LB2-4B1)；低溫高速離心機(jī)(艾本德型號(hào)5424R)；全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國伯樂，型號(hào)CFX96 Deep Well)；全自動(dòng)核酸提取儀(德國凱杰，型號(hào)QIAcube connect)；核酸提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，德國凱杰生物公司)；恒溫?cái)U(kuò)增芯片核酸分析儀(RTisochip-A，博奧生物)；微量移液器(德國艾本德公司)；呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫芯片法，博奧生物，貨號(hào)302010)。

1.3 菌株來源 呼吸道病原體菌株來源于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株以及本院檢驗(yàn)科微生物室分離培養(yǎng)，包括銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，Pae)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，Spn)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，Sau)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，Kpn)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)、流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae，Hin)。整個(gè)過程按照國家傳染性病原體的安全操作規(guī)范進(jìn)行。

1.4 核酸提取 痰液標(biāo)本采用消化液(4% NaOH溶液)消化15～30 min至痰液呈水樣，若消化不完全可適當(dāng)延長消化時(shí)間，采用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，Germany)，根據(jù)試劑盒提取說明書，采用全自動(dòng)核酸提取儀提取核酸，提取的核酸立即檢測(cè)，若24 h內(nèi)能檢測(cè)置于-20℃冰箱保存，若長期保存需置于-70℃冰箱。

1.5 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè) 采用呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片法)，根據(jù)說明書配制擴(kuò)增試劑，體系如下：20 μl檢測(cè)緩沖液(包含檢測(cè)引物及酶液等)和36.5 μl呼吸道病原體核酸，渦旋震蕩，瞬時(shí)離心之后加入檢測(cè)芯片，上機(jī)檢測(cè)，反應(yīng)程序如下：37℃ 3 min，65℃ 1 min(采集熒光信號(hào))，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。

1.6 多重PCR檢測(cè) 參照邸紅芹等[5]構(gòu)建的呼吸道多重PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)液(Taqman Fast Virus One-step Master Mix，Invitrogen)13.5 μl，各引物/探針(終濃度為0.4 μmol/L)1.5 μl以及10 μl核酸。然后將各反應(yīng)管按以下程序在實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Roche 480)上進(jìn)行PCR反應(yīng)：50℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動(dòng))；95℃，15 s(變性)，60℃，45 s(退火/延伸，采集熒光信號(hào))，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。

1.7 結(jié)果判定 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行結(jié)果分析，所有陰性樣本的信號(hào)值都應(yīng)低于閾值；當(dāng)Ct值>35時(shí)，樣本低于檢測(cè)閾值線，結(jié)果判定為呼吸道病原體核酸陰性；當(dāng)Ct值≤35時(shí)，結(jié)果判定為呼吸道病原體核酸陽性。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法擴(kuò)增陽性的樣品會(huì)產(chǎn)生類似實(shí)時(shí)熒光的“S”形擴(kuò)增曲線，進(jìn)一步完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增和檢測(cè)，每張芯片內(nèi)均設(shè)有1個(gè)陽性質(zhì)控和9個(gè)陰性質(zhì)控，采用ROC法計(jì)算得到待檢病原菌的陽性判斷值，通過檢測(cè)軟件自動(dòng)判讀，當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值≤該指標(biāo)的陽性判斷值且陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控均正常時(shí)，判讀為呼吸道病原體核酸陽性；當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)的Tp值>該指標(biāo)的陽性判斷值且陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控均正常時(shí)，判讀為呼吸道病原體核酸陰性。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果判定 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，采用機(jī)器自帶軟件進(jìn)行擴(kuò)增圖片分析，相應(yīng)的檢測(cè)通道顯示各類呼吸道病原體核酸擴(kuò)增結(jié)果，以流感嗜血桿菌(HIN)核酸擴(kuò)增檢測(cè)為例，呈“S”型擴(kuò)增曲線，陰陽性質(zhì)控都在控，顯示檢測(cè)有效。見圖1。

圖1 呼吸道病原體核酸檢測(cè)擴(kuò)增曲線；A多重?zé)晒舛縋CR法檢測(cè)流感嗜血桿菌核酸擴(kuò)增曲線；B恒溫芯片法檢測(cè)流感嗜血桿菌核酸擴(kuò)增曲線，紅色曲線為擴(kuò)增曲線，另外兩條擴(kuò)增曲線為外質(zhì)控和陽性對(duì)照

2.2 多重?zé)晒舛縋CR法性能評(píng)估 采用多重?zé)晒舛縋CR法和恒溫芯片法同時(shí)對(duì)呼吸道病原體標(biāo)準(zhǔn)菌株(包括銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌、流感嗜血桿菌)進(jìn)行檢測(cè)，以恒溫芯片法檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示多重?zé)晒舛縋CR法各個(gè)檢測(cè)通道無相互干擾，具有很高的一致性和特異性。見表1。

表1 多重?zé)晒舛縋CR與恒溫芯片法一致性和特異性分析

2.3 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果分析 多重?zé)晒舛縋CR法和恒溫芯片擴(kuò)增法同時(shí)對(duì)123例呼吸道疾病患者痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，恒溫芯片法檢出陽性率為43.09(53/123)，多重?zé)晒舛縋CR法檢出陽性率為47.15%(58/123)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.410，P=0.522)。多重?zé)晒舛縋CR法與恒溫芯片法對(duì)常見呼吸道病原體如：銅綠假單胞菌(χ2=0.200，P=0.655)、肺炎鏈球菌(χ2=0.063，P=0.802)、金黃色葡萄球菌(χ2=0.063，P=0.802)、肺炎克雷伯菌(χ2=0.048，P=0.827)、結(jié)核分枝桿菌(χ2=0.478，P=0.689)、流感嗜血桿菌(χ2=0.185，P=0.667)的檢測(cè)結(jié)果顯示，多重?zé)晒舛縋CR法和恒溫芯片擴(kuò)增法的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。一致性分析顯示多重?zé)晒舛縋CR法和恒溫芯片擴(kuò)增法對(duì)常見呼吸道病原體檢測(cè)，包括：銅綠假單胞菌(Kappa=0.900)、肺炎鏈球菌(Kappa=937)、金黃色葡萄球菌(Kappa=0.937)、肺炎克雷伯菌(Kappa=0.952)、結(jié)核分枝桿菌(Kappa=0.854)及流感嗜血桿菌(Kappa=0.908)均具有高度一致性(Kappa均>0.75)。見表2。

表2 多重?zé)晒舛縋CR與恒溫芯片法對(duì)呼吸道病原體檢出比較

3 討論

引起呼吸道感染的病原體種類多且癥狀大多相似，臨床醫(yī)生很難準(zhǔn)確診斷病因，因此，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出患者所感染的呼吸道病原體尤為重要。近年，適用于檢測(cè)病原體的分子生物學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，核酸檢測(cè)技術(shù)由于其高敏感性、便捷性和簡便性，越來越多的用于臨床實(shí)驗(yàn)室呼吸道病原體的常規(guī)診斷，如熒光定量PCR[6-8]、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[9-12]以及芯片技術(shù)[13-15]、測(cè)序技術(shù)[16-18]等。呼吸道病原體的高通量檢測(cè)也越來越普及，其中比較常用的有多重?zé)啥縋CR法、恒溫微流控芯片法以及測(cè)序法。徐嘉楠等[19]運(yùn)用多重PCR技術(shù)聯(lián)合熔解曲線(Tm)快速檢測(cè)并區(qū)分22種呼吸道感染相關(guān)的病原體，結(jié)果顯示這種基于多重PCR技術(shù)的檢測(cè)試劑盒不僅極大縮短檢測(cè)時(shí)間，得到較高的陽性率，且其操作技術(shù)也較常規(guī)方法更簡便；李艷燕等[20]采用基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)結(jié)合微流控芯片，進(jìn)行13種常見下呼吸道病原體檢測(cè)，該方法簡單快速、試劑耗量低、自動(dòng)化程度高，提高了檢測(cè)敏感性，具備了對(duì)呼吸道感染性疾病的快速診斷能力，極大縮短了檢驗(yàn)周期。呂園等[21]對(duì)13種呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑(PCR毛細(xì)管電泳片段分析方法)進(jìn)行性能驗(yàn)證，證實(shí)該試劑盒滿足交叉反應(yīng)、符合率及抗干擾能力等要求，可用于臨床呼吸道樣本的檢測(cè)?？梢姾怂釞z測(cè)技術(shù)的應(yīng)用將成為廣譜呼吸道病原體檢測(cè)的新方向。

本研究將多重PCR與熒光定量PCR相結(jié)合建立多重?zé)晒舛縋CR(MRT-PCR)體系，針對(duì)呼吸道病原體核酸序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，同時(shí)綜合兩種檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)能夠快速、高通量的檢測(cè)常見的呼吸道病原體[5]。以恒溫芯片法為參照[22，23]，一致性分析顯示多重?zé)晒舛縋CR體系間各檢測(cè)通道干擾，具有很高的特異性(表1)。同時(shí)，對(duì)123例呼吸道疾病患者痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示，恒溫芯片法檢出陽性率為43.09%(53/123)，多重?zé)晒舛縋CR法檢出陽性率為47.15%(58/123)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.410，P=0.522)，顯示多重?zé)晒舛縋CR可用于呼吸道病原體的檢測(cè)。

本研究對(duì)兩種方法的操作簡便性和時(shí)效性進(jìn)行比較，兩種方法樣本處理及核酸提取的過程相同，結(jié)果判讀都是根據(jù)Ct值。恒溫芯片檢測(cè)試劑盒一次能同時(shí)檢測(cè)13種病原體，但每次只能檢測(cè)1個(gè)樣本；多重?zé)晒舛縋CR法一次能同時(shí)檢測(cè)15種病原體，每次檢測(cè)量依據(jù)PCR儀的通量而定，每份樣本需要1個(gè)八聯(lián)排PCR管。操作步驟方面，恒溫芯片檢測(cè)試劑盒操作較簡便，僅需一步操作即可完成；而多重?zé)晒舛縋CR需要配置多個(gè)試劑盒，需要手工操作的步驟比較多。儀器要求方面，恒溫芯片檢測(cè)試劑盒完成所有病原體的檢測(cè)需要相應(yīng)的恒溫檢測(cè)儀，1 h以內(nèi)即可完成，但如果需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，則需要增加儀器的數(shù)量；多重?zé)晒舛縋CR法需要PCR儀，2.5～3 h完成檢測(cè)，儀器越多或通量越大檢測(cè)樣本數(shù)量越多。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)際情況來選擇合適的檢測(cè)方法。

本研究將與恒溫芯法檢測(cè)試劑盒共有的7種常見呼吸病原體：銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌、流感嗜血桿菌進(jìn)行檢測(cè)性能分析。多重?zé)晒舛縋CR法和恒溫芯片法對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌、流感嗜血桿菌的陽性檢出分別為12例(9.76%)、9例(7.32%)、8例(6.50%)、11例(8.94%)、22例(17.89%)、11例(8.94%)和10例(8.13%)、8例(6.50%)、9例(7.32%)、12例(9.76)、18例(14.63%)、13例(10.57%)，同時(shí)對(duì)陽性檢出進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，一致性分析Kappa值顯示兩種檢測(cè)方法具有高度一致性(Kappa>0.75)。本研究因未評(píng)估多重?zé)晒舛縋CR體系中其他病原體如流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠狀病毒的檢測(cè)性能，具有一定的局限性，同時(shí)增加樣本量并應(yīng)采用更多相似的商品化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行進(jìn)一步地性能驗(yàn)證。

綜上所述，構(gòu)建多重?zé)晒舛縋CR體系與恒溫芯片檢測(cè)法對(duì)常見呼吸道病原體的檢測(cè)敏感性和特異性相近，可用于快速、高通量篩查多種呼吸道病原體，具有良好的應(yīng)用前景。