苜蓿鹽誘變愈傷組織的生理生化特性

楊靜慧，王 葳，秦艷筠，劉艷軍，張景新，張 超（.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 0084，.天津市薊縣林業(yè)局，天津0900， .天津市朔方綠化科技有限公司，天津 0084）

試驗研究

苜蓿鹽誘變愈傷組織的生理生化特性

楊靜慧1，王 葳1，秦艷筠1，劉艷軍1，張景新2，張 超3
（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384，2.天津市薊縣林業(yè)局，天津301900， 3.天津市朔方綠化科技有限公司，天津 300384）

為了了解耐鹽突變體的生理變化，以“青睞”苜蓿耐鹽突變體的愈傷組織為試材，檢測了該組織的細(xì)胞可溶性糖、丙二醛、可溶性蛋白、游離脯氨酸等的含量，分析了其細(xì)胞膜透性、離子濃度和SOD、POD酶活性。結(jié)果顯示，與對照相比耐鹽突變體細(xì)胞中有更多的可溶性糖、游離脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白和Na+、K+，細(xì)胞膜的透性更高。但其SOD和POD的酶活性的變化規(guī)律不明顯。

苜蓿；愈傷組織；耐鹽；生理指標(biāo)

苜蓿是豆科苜蓿屬的多年生草本植物，是一種全球性栽培、營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性廣、適口性優(yōu)良的飼料作物，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱[1]。同時苜蓿也可以作為綠肥、輪作倒茬作物、護(hù)地固地和草坪綠化觀賞植物[2]。然而，50～200 mmol·L-1NaCl脅迫就會顯著降低苜蓿的產(chǎn)量[3]。目前，全世界的鹽漬地約占陸地面積的30%，而中國的鹽漬地比例明顯高于世界平均水平，天津東部濱海平原區(qū)土壤鹽漬化尤其嚴(yán)重[4]。如果可以提高苜蓿的耐鹽性，在鹽漬地區(qū)種植苜蓿，既可以改良土壤綠化環(huán)境，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。通過對耐鹽苜蓿突變體愈傷組織的8項生理指標(biāo)的研究，了解突變體在生理生化代謝上的變化規(guī)律，為耐鹽苜蓿的育種提供了理論依據(jù)。

1　材料和方法

試驗使用的對照苜蓿品種“青睞”購于中國農(nóng)科院，耐鹽愈傷組織由天津農(nóng)學(xué)院植物教研室提供，通過高鹽篩選獲得的突變體細(xì)胞系，方法見劉艷軍和QIN Y J的研究報道[5-6]。取耐鹽突變體和對照的子葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，方法見QIN Y J的報道[6]。愈傷組織生理指標(biāo)測定方法為：可溶性糖含量用蒽酮法、SOD酶活性用氮藍(lán)四唑光化還原法、POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚比色法和Lambda35紫外分光光度計測定、丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法和用Lambda35紫外分光光度計測定、細(xì)胞膜透性用電導(dǎo)率法、可溶性蛋白含量用紫外吸收法、游離脯氨酸含量用茚三酮顯色法、Na+和K+含量用原子分光光度計測定（PerkinElmer AAnalyst 400型）。每處理3次重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量

圖1顯示，耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量高于對照愈傷組織。對照可溶性糖含量為25.03%，耐鹽愈傷組織含量為27.42%，是對照的 1.1倍?？扇苄蕴鞘且环N重要的滲透調(diào)節(jié)劑；也是合成有機(jī)物的碳架和能量來源；對細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體有穩(wěn)定作用；還可在細(xì)胞內(nèi)無機(jī)離子含量高時起保護(hù)酶類的作用[7]。耐鹽愈傷組織可溶性糖含量高，說明其滲透壓較高，所以在鹽濃度較高的環(huán)境中可以更容易從外界吸收水分來維持生長。

圖1　耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量

2.2耐鹽愈傷組織的SOD酶活性

圖2顯示，耐鹽愈傷的SOD酶活性低于對照愈傷組織。對照的SOD酶活性為3.04 U，耐鹽愈傷的為2.20 U，前者是后者的1.38倍。有關(guān)研究表明，植物體在鹽脅迫下SOD的活性的變化因植物種類不同而不同[8-10]。組織中SOD酶活性低的可能表示需要較高的鹽濃度才能造成對組織的脅迫引起反應(yīng)，也說明該組織的耐鹽性強(qiáng)。

圖2　耐鹽愈傷組織的SOD酶活性

2.3耐鹽愈傷的POD酶活性

圖3顯示，耐鹽愈傷組織的POD酶活性高于對照愈傷組織。對照的POD酶活性為25.35 U，耐鹽愈傷組織的POD酶活性為34.81 U，后者是前者的1.37倍。POD酶的作用是清除過氧化氫，以免損傷自身細(xì)胞[11]。有報道顯示具有較高的POD酶活性的植物，具有較強(qiáng)的耐鹽性；但是，也有相反的報道[6,9,10.12]。

圖3　耐鹽愈傷組織的POD酶活性

2.4耐鹽愈傷組織的丙二醛含量

圖4顯示，耐鹽愈傷組織的丙二醛含量低于對照愈傷組織。對照丙二醛含量為0.79 μ mol· g-1，耐鹽愈傷組織含量為0.45 μ mol·g-1，前者是后者的1.77倍。丙二醛是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量高低是顯示膜脂過氧化強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，其數(shù)值越大，表示質(zhì)膜受到的傷害越大，其耐鹽性也越差[6]。

圖4　耐鹽愈傷組織的丙二醛含量

2.5耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性

圖5顯示，愈傷組織中細(xì)胞膜透性都較低（<0.32%），其中耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性高于對照。對照愈傷組織的細(xì)胞膜透性為0.13%，耐鹽愈傷的細(xì)胞膜透性為0.31%，后者是前者的2.38倍。鹽脅迫以及其他任何環(huán)境脅迫所造成的植物細(xì)胞膜的損壞，會使細(xì)胞膜的透性增大[13]。但是，本試驗高壓篩選出來的愈傷組織生長旺盛，無任何受害癥狀，生理代謝也正常。所以在正常生長條件下，耐鹽愈傷組織細(xì)胞具有更高的細(xì)胞膜透性。

圖5　耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性

2.6耐鹽愈傷組織的可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量

圖6和圖7顯示，耐鹽愈傷的可溶性蛋白含量低于對照愈傷組織，但游離脯氨酸含量高于對照愈傷組織。對照愈傷組織中的可溶性蛋白含量為2.25 mg·mL-1，耐鹽愈傷中可溶性蛋白含量為1.91 mg·mL-1，前者是后者的1.18倍；對照愈傷組織中的游離脯氨酸含量為94.84 μ g·g-1，耐鹽愈傷中的游離脯氨酸含量為599.87 μ g·g-1，后者是前者的6.33倍。邵紅雨等[7]在植物耐鹽生理生化特性的研究中指出，脯氨酸是一種重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離的狀態(tài)廣泛存在于植物體內(nèi)。植物在鹽脅迫等逆境條件下積累游離脯氨酸是一種比較普遍的現(xiàn)象。游離脯氨酸積累的作用大致有：（1）可以作為細(xì)胞的有效調(diào)節(jié)物質(zhì)；（2）具有保護(hù)酶和膜的作用；（3）可以直接利用的無毒形式的氮源。所以，上述結(jié)果表明經(jīng)過高鹽脅迫誘變得到的耐鹽愈傷組織具有將細(xì)胞中大量的可溶性蛋白轉(zhuǎn)化為游離脯氨酸的功能，這應(yīng)是其耐鹽的原因之一。

圖6　耐鹽愈傷組織的可溶性蛋白含量

圖7　耐鹽愈傷組織的游離脯氨酸含量

2.7耐鹽愈傷組織的Na+、K+濃度

圖8顯示，耐鹽愈傷組織的Na+、 K+濃度低于對照愈傷組織。對照愈傷組織中Na+含量為5.70 mg·L-1，耐鹽愈傷中Na+含量為2.90 mg· L-1，前者是后者的1.97倍；對照愈傷組織中的K+含量為4.81 mg·L-1，耐鹽愈傷中的K+含量為4.04 mg·L-1，前者是后者的1.2倍。對照愈傷組織的K+/ Na+為0.84 ，耐鹽愈傷的K+/ Na+為1.39，后者是前者的1.65倍。耐鹽愈傷中的Na+濃度明顯下降，雖然K+濃度也有所下降，但K+/ Na+較對照愈傷組織升高許多。這可有效維持生長發(fā)育所需的K+/ Na+，提高對Na+脅迫的耐受性[14]。

圖8　耐鹽愈傷組織的K+、Na+離子濃度變化

3　結(jié) 論

綜上所述，與普通愈傷組織相比，耐鹽愈傷組織細(xì)胞中有更多的可溶性糖、游離脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白、Na+、K+離子，更高的細(xì)胞膜透性。其SOD和POD酶活性的變化需要進(jìn)一步論證。

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S551+.703.4

A

1002-0659（2016）04-0001-03

2016-03-22

主要作者簡介：楊靜慧（1961-），女，教授，博士，主要從事園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com