富血小板血漿在兔外傷性視神經(jīng)損傷中的修復(fù)作用及其機(jī)制

李琳玲 邢怡橋

武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科 430061

李琳玲現(xiàn)在深圳市婦幼保健院 518000

外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathies，TON)是由于外傷直接或間接導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷，是顱腦損傷后視力永久性喪失的主要原因之一[1]。尋求視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)和視網(wǎng)膜修復(fù)再生的方法、探索改善視神經(jīng)功能的治療策略是眼科研究的熱點(diǎn)[2]。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是全血經(jīng)過離心分離而得到的血液制品，含有多種生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，在肌肉和骨骼等多種組織的損傷修復(fù)和再生過程中起重要作用[3]。此外，PRP可作為組織工程應(yīng)用的自體來源，作為骨髓干細(xì)胞顱內(nèi)給藥的支架，可顯著改善誘導(dǎo)性腦出血實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)功能[4]。隨著PRP在臨床的應(yīng)用越來越廣泛，也有研究發(fā)現(xiàn)PRP可改善接受體外人工受孕治療患者的子宮內(nèi)膜厚度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)不良導(dǎo)致不孕癥的治療[5]。然而，PRP對(duì)視神經(jīng)損傷修復(fù)作用的研究較少。目前常用的視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型主要有視神經(jīng)橫斷傷、視神經(jīng)撞擊傷、視神經(jīng)牽拉傷、視神經(jīng)擠壓傷、視神經(jīng)鉗夾傷等動(dòng)物模型。視神經(jīng)橫斷傷動(dòng)物模型可造成所有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)軸突完全切斷[6]。視神經(jīng)撞擊傷動(dòng)物模型接近臨床的間接視神經(jīng)損傷，但是致傷設(shè)備復(fù)雜、操作繁瑣、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷較大，死亡率高[7]。視神經(jīng)牽拉傷動(dòng)物模型致傷裝置復(fù)雜、手術(shù)步驟較多且操作難度較大[8]。視神經(jīng)擠壓傷動(dòng)物模型手術(shù)操作簡(jiǎn)單，但難以保證造成損傷程度均一[9]。視神經(jīng)鉗夾傷模型是目前實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用最廣泛的方法，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、易于操作、創(chuàng)傷性小、造模成功率高，且能夠保證視神經(jīng)髓鞘的完整性等特點(diǎn)[10-11]。本研究觀察兔視神經(jīng)鉗夾傷模型中視網(wǎng)膜和視神經(jīng)受損情況，并探索PRP對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)新西蘭白兔52只，購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心，體質(zhì)量2.3～2.5 kg，雌雄不限，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。兔自由攝食飲水，全價(jià)兔顆粒飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)遵循美國(guó)視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)制定的科研動(dòng)物使用規(guī)范。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：E2019072805)。

1.1.2主要試劑及儀器 B淋巴細(xì)胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(12789-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；caspase-3抗體(ab4051，英國(guó)Abcam公司)；TRIpure總RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EnTurboTMSYBR Green PCR擴(kuò)增試劑盒(武漢科鹿生物技術(shù)有限公司)；鼠抗兔腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體(bs-0248R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；鼠抗兔生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43，Gap-43)抗體(A6376，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG抗體(AS-1107)、山羊抗鼠IgG抗體(AS-1106)(美國(guó)Aspen公司)。倒置顯微鏡(德國(guó)Olympus公司)；StepOneTMReal-Time PCR儀(美國(guó)Life生物科技公司)；Nanodrop紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1兔視神經(jīng)鉗夾傷模型制備 取40只實(shí)驗(yàn)兔以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉沿耳緣靜脈按0.3 ml/100 g劑量注射麻醉，沿右眼球后向深部分離視神經(jīng)約5 mm，避免損傷鄰近血管，于球后3 mm處用同一顯微血管夾夾持視神經(jīng)30 s。觀察術(shù)眼瞳孔散大且無視網(wǎng)膜出血，逐層縫合后于上眼瞼及結(jié)膜囊內(nèi)涂左氧氟沙星眼膏。待實(shí)驗(yàn)兔麻醉蘇醒，觀察瞳孔散大、直接對(duì)光反應(yīng)消失、術(shù)眼角膜透明、玻璃體腔無積血、視網(wǎng)膜無出血或剝脫、眼壓正常、無眼球突出或眼瞼閉合不全者判定為造模成功并納入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2PRP的制備 以注射器沿兔耳中央動(dòng)脈取血，1次約10 ml，置于無菌離心管內(nèi)，離心半徑10 cm，2 000 r/min離心10 min；獲得上層血漿層、血小板層和下層紅細(xì)胞層，抽提去除下層紅細(xì)胞后搖勻，置于離心機(jī)內(nèi)，2 200 r/min離心10 min；去除上層血漿層，獲得兔自體PRP，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)兔因麻醉意外死亡4只，將造模成功的36只實(shí)驗(yàn)兔按照隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為模型對(duì)照組、生理鹽水組和PRP組，每組12只。PRP組和生理鹽水組術(shù)眼造模后每隔1 d于球后近視神經(jīng)損傷處分別注射PRP和生理鹽水各20 μl，共注射10次。模型對(duì)照組除常規(guī)抗感染外不做特殊處理。另取12只正常新西蘭大白兔作為正常對(duì)照組，不做造模和PRP注射處理。

1.2.4實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜及視神經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)檢查 于造模后30 d、60 d各組任意選取3只實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈注射過量1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)處死，摘取動(dòng)物右側(cè)眼球及球后視神經(jīng)，將視網(wǎng)膜和視神經(jīng)分段，于眼球12：00方向及視神經(jīng)近鉗夾處縫線標(biāo)記，置于-80 ℃冰箱保存。取眼球和鉗夾處遠(yuǎn)側(cè)視神經(jīng)組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定24～72 h，制作石蠟切片，分別沿視網(wǎng)膜經(jīng)視神經(jīng)處12：00方向矢狀切片及視神經(jīng)鉗夾處遠(yuǎn)端垂直于視神經(jīng)長(zhǎng)軸方向切片，切片厚度為4 μm，采用蘇木精-伊紅法進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察并攝像，任意選擇3個(gè)200倍視野下區(qū)域計(jì)數(shù)RGCs，測(cè)定視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)厚度。

1.2.5甲苯胺藍(lán)染色及免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定視神經(jīng)內(nèi)軸突和視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況 取造模后30 d、60 d正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和PRP組的視神經(jīng)組織石蠟切片，采用甲苯胺藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察視神經(jīng)內(nèi)軸突瓦解及修復(fù)情況并攝像。取模型對(duì)照組和PRP組視網(wǎng)膜組織石蠟切片滴加Bcl-2(1∶ 300)或caspase-3(1∶ 100)一抗，4 ℃條件下孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌，滴加山羊抗兔二抗(1∶ 200)，于室溫下靜置15 min，用PBS洗滌后，進(jìn)行3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)染色，然后用水沖洗，蘇木素復(fù)染。使用Image Pro plus軟件測(cè)定各組陽(yáng)性染色區(qū)的吸光度(A)值。計(jì)算單位面積平均A值=陽(yáng)性染色積分A值/總目標(biāo)組織面積A值。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43 mRNA表達(dá) 造模后30 d和60 d各組分別處死3只大鼠，迅速取出實(shí)驗(yàn)兔眼球，分離視網(wǎng)膜，立即置于液氮中凍存，提取視網(wǎng)膜總RNA，采用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量及純度；將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)體系為2倍Master Mix 5.0 μl、引物(2.5 μmol/L)1.0 μl、cDNA模板1.0 μl、雙蒸餾水2.0 μl和Rox參比染料1.0 μl，各基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參照，采用2-△△CT法分別計(jì)算視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence基因引物信息引物序列Tm值(℃)產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)GAPDHNM_001082253.1F:5’-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3’59.0104R:5’-ACGACCTGGTCCTCGGTG-TA-3’59.9GAP-43XM_008266894.2F:5’-ACCAAAATTCAG-GCGAGCTT-3’59.2218R:5’-GGAGTTTCTCCTGCTTT-GCC-3’58.9BDNFXM_017345633.1F:5’-AGACAGGTTCAAGAGGCCTGAC-3’59.9234R:5’-GCCGGACCCTCATAGA-CATG-3’60.0 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Gap-43:生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43;BDNF:腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子;F:正向引物;R:反向引物 Note:PCR:polymerization chain reaction;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;Gap-43:growth associated protein-43;BDNF:brain-derived neurotrophic factor;F:forward;R:reverse

1.2.7Western blot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF和Gap-43蛋白表達(dá) 取各組兔實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜和鉗夾處遠(yuǎn)側(cè)的視神經(jīng)，預(yù)冷的PBS漂洗，加入10倍體積的含蛋白酶抑制劑的組織蛋白提取試劑，冰浴下徹底勻漿，4 ℃條件下13 000×g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，上樣后按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，按300 mA恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入封閉液37 ℃封閉1 h，分別滴加鼠抗兔BDNF一抗(1∶ 500)和鼠抗兔Gap-43一抗(1∶ 500)。TBST洗膜3次，每次5 min，滴加山羊抗鼠IgG二抗(1∶ 10 000)，37℃搖床孵育0.5 h，TBST洗膜4次，每次5 min。ECL顯色，暗室中曝光，將膠片掃描，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，以mean±SD進(jìn)行表達(dá)。采用隨機(jī)分組單因素干預(yù)多水平研究設(shè)計(jì)，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、生理鹽水組和PRP組造模后不同時(shí)間點(diǎn)各檢測(cè)指標(biāo)的總體差異比較采用兩因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)兔視神經(jīng)大體觀及甲苯胺藍(lán)染色

模型對(duì)照組視神經(jīng)直徑均較正常對(duì)照組變細(xì)，鉗夾處視神經(jīng)明顯凹陷，且模型對(duì)照組造模后60 d視神經(jīng)萎縮程度較造模后30 d更嚴(yán)重(圖1)。PRP組造模后60 d視神經(jīng)直徑較造模后30 d有所恢復(fù)，鉗夾夾痕逐漸消失。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，造模后30 d，模型對(duì)照組兔視神經(jīng)軸突丟失，大多數(shù)軸突瓦解，未見正常軸突，PRP組兔視神經(jīng)僅中央部分有部分軸突水腫，纖維膜稍增厚，周邊可見排列緊密的正常軸突；造模后60 d，模型對(duì)照組兔視神經(jīng)內(nèi)散在分布藍(lán)色染料，視神經(jīng)軸突丟失更為明顯，多數(shù)軸突瓦解，僅剩部分殘留的小軸突，纖維膜增厚明顯，軸突束直徑變小，PRP組視神經(jīng)中央水腫程度逐漸減輕，組織排列更為緊密(圖2)。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)外觀變化 A：造模后30 d正常對(duì)照組(L)和模型對(duì)照組(R)視神經(jīng)外觀 B：造模后30 d正常對(duì)照組(L)和PRP組(R)視神經(jīng)外觀 C：造模后60 d正常對(duì)照組(L)和模型對(duì)照組(R)視神經(jīng)外觀 D：造模后60 d正常對(duì)照組(L)和PRP組(R)視神經(jīng)外觀Figure 1 Appearance changes of optical nerve in different groups at different time points A:The optic nerve in normal control group (L) and model control group (R) at 30 days after modeling B:The optic nerve in normal control group (L) and PRP group (R) at 30 days after modeling C:The optic nerve in normal control group (L) and model control group (R) at 60 days after modeling D:The optic nerve in normal control group (L) and PRP group (R) at 60 days after modeling

圖2 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和PRP組兔眼視神經(jīng)組織學(xué)變化(甲苯胺藍(lán)染色 ×400，標(biāo)尺=500 μm) 正常對(duì)照組可見軸突束由纖維膜包繞，排列均勻；造模后30 d和60 d，模型對(duì)照組兔視神經(jīng)軸突丟失，大多數(shù)軸突瓦解，未見正常軸突，PRP組兔視神經(jīng)僅中央有部分軸突水腫，纖維膜稍增厚，周邊可見排列緊密的正常軸突 黑色箭頭示軸突束，紅色箭頭示纖維膜 PRP：富血小板血漿Figure 2 Histological changes of optic nerve in the normal control group,model control group and PRP group (Toluidine blue ×400,bar=500 μm) In the normal control group,axon bundles surrounded by fibrous membrane and evenly arranged were observed.At 30 and 60 days after modeling,the axons of the optic nerve in the model control group were lost,and most axons disintegrated and no normal axon was observed.Only part of the axons in the central part of the optic nerve were edematous,and the fibrous membrane was slightly thickened,and normal axons were closely arranged around in the PRP group Black arrows indicated axon bundles,and red arrows indicated fibrous membrane PRP:platelet-rich plasma

2.2 各組實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化

造模后30 d，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜可見清晰的3層細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，RGCs層呈現(xiàn)單層、整齊且排列密集，細(xì)胞核數(shù)目清楚，相對(duì)較少，可見光滑完整且無褶皺核膜，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻。模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，RGCs形態(tài)異常，感光細(xì)胞層及雙極細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，各細(xì)胞層厚度變薄。PRP組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞數(shù)較模型對(duì)照組增多，但仍少于正常對(duì)照組，細(xì)胞排列較模型對(duì)照組整齊(圖3)。

圖3 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和PRP組造模后30 d視網(wǎng)膜組織形態(tài)(HE ×200，標(biāo)尺=100 μm) A：正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織形態(tài) 視網(wǎng)膜各層排列規(guī)則，可見感光細(xì)胞層(紅色箭頭)、雙極細(xì)胞層(黃色箭頭)和RGCs層(黑色箭頭) B：模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織形態(tài) 可見視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，RGCs形態(tài)異常，感光細(xì)胞層及雙極細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目均明顯減少 C：PRP組兔視網(wǎng)膜組織形態(tài) 可見細(xì)胞排列較模型對(duì)照組整齊，各層細(xì)胞數(shù)較模型對(duì)照組增多 PRP：富血小板血漿Figure 3 Retinal tissue morphology in the normal control group,model control group and PRP group (HE ×200,bar=100 μm) A:The morphology of retinal tissue in the normal control group Layers of the retina were arranged regularly,and the photoreceptor cell layer (red arrow),bipolar cell layer (yellow arrow) and RGCs layer (black arrow) were visible B:The morphology of retinal tissue in the model control group Layers of the retina were disordered,and the RGCs layer was abnormal,and the cells number of photoreceptor cell layer and bipolar cell layer were decreased C:The morphology of retinal tissue in the PRP group The cells arrangement was more regular and the cells number of different layers were more than those of the model control group PRP:platelet-rich plasma

2.3 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)量和RNFL厚度變化

各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=80.33，P<0.001；F時(shí)間=2.64，P<0.001)；造模后30 d和60 d，PRP組RGCs數(shù)量均較生理鹽水組和模型對(duì)照組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，PRP組造模后60 d RGCs數(shù)量較造模后30 d明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后不同時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)量和RNFL厚度比較(mean±SD)Table 2 Comparisons of RGCs and RNFL thickness in different time points among the four groups (mean±SD)組別造模后不同時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)量(/視野)造模后不同時(shí)間點(diǎn)RNFL厚度(μm)30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組38.33±8.39a35.00±7.00a22.28±3.17a22.31±2.22a模型對(duì)照組6.33±0.58a10.33±1.53ab4.80±0.43a2.18±0.23ab生理鹽水組4.67±1.15a8.00±1.00ab4.76±0.68a2.01±0.25abPRP組13.00±1.0020.00±2.65b6.60±1.166.89±1.21 注:RGCs:F分組=80.33,P<0.01;F時(shí)間=2.64,P<0.01;RNFL:F分組=36.83,P<0.01;F時(shí)間=21.67,P<0.01.與各時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) RGCs:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;RNFL:視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層;PRP:富血小板血漿 Note:RGCs:Fgroup=80.33,P<0.01;Ftime=2.64,P<0.01;RNFL:Fgroup=36.83,P<0.01;Ftime=21.67,P<0.01.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with respective val-ues at 30 days after modeling,bP<0.05(Two-way ANOVA,LSD-t test) RGCs:retinal ganglion cells;RN-FL:retinal nerve fiber layer;PRP:platelet-rich plasma

各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)RNFL厚度總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=36.83，P<0.01；F時(shí)間=21.67，P<0.01)；造模后30 d，PRP組RNFL厚度較模型對(duì)照組和生理鹽水組明顯增加，模型對(duì)照組和生理鹽水組造模后60 d RNFL厚度較造模后30 d減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；PRP組造模后60 d RNFL厚度與造模后30 d比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.4 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=128.50，P<0.01；F時(shí)間=21.55，P<0.01)；造模后30 d和60 d，PRP組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值均較模型對(duì)照組和生理鹽水組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。模型對(duì)照組和生理鹽水組造模后60 d Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值明顯低于造模后30 d，PRP組造模后60 d Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值明顯高于造模后30 d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，表3)。

Caspase-3蛋白陽(yáng)性主要表現(xiàn)在RGC層和內(nèi)核層，而在視網(wǎng)膜外核層中未見表達(dá)。各組間視網(wǎng)膜caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=121.00，P<0.01)，不同時(shí)間點(diǎn)間視網(wǎng)膜caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值總體比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=0.554，P>0.05)。造模后30 d和60 d，生理鹽水組和模型對(duì)照組視網(wǎng)膜caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值均明顯高于正常對(duì)照組和PRP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，表3)。

圖4 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和PRP組造模后30 d視網(wǎng)膜中Bcl-2和caspase-3蛋白表達(dá)分布(DAB ×200，標(biāo)尺=100 μm) 正常對(duì)照組和PRP組Bcl-2陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于模型對(duì)照組，caspase-3陽(yáng)性染色強(qiáng)度明顯弱于模型對(duì)照組 PRP：富血小板血漿Figure 4 Distribution of Bcl-2 and caspase-3 protein expression in retina of normal control group,model control group and PRP group at 30 days after modeling (DAB ×200,bar=100 μm) The positive staining intensity of Bcl-2 was stronger,while the positive staining intensity of caspase-3 was weaker in the normal control group and PRP group than those in the model group PRP:platelet-rich plasma

表3 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中Bcl-2和caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值比較(mean±SD)Table 3 Comparison of A value of Bcl-2 and caspase-3 protein positive expression in retina at different time points after modeling among the four groups (mean±SD)組別造模后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值造模后不同時(shí)間caspase-3點(diǎn)蛋白陽(yáng)性表達(dá)A值30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組0.0143±0.0013a0.0136±0.0008a0.0054±0.0015a0.0046±0.0032模型對(duì)照組0.0057±0.0016a0.0007±0.0001ab0.0250±0.0007a0.0307±0.0050a生理鹽水組0.0063±0.0016a0.0017±0.0007ab0.0247±0.0026a0.0285±0.0003aPRP組0.0087±0.00100.0107±0.0008a0.0134±0.00070.0078±0.0026 注:Bcl-2:F分組=128.50,P<0.01;F時(shí)間=21.55,P<0.01.caspase-3:F分組=121.00,P<0.01;F時(shí)間=0.553,P>0.05.與各自時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) PRP:富血小板血漿 Note:Bcl-2:Fgroup=128.50,P<0.01;Ftime=21.55,P<0.01.caspase-3:Fgroup=121.00,P<0.01;Ftime=0.553,P>0.05.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with corresponding values at 30 days after modeling in each group,bP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) PRP:platelet-rich plasma

2.5 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BDNF：F分組=1 164.00，P<0.01；F時(shí)間=240.90，P<0.01.Gap-43：F分組=1 477.00，P<0.01；F時(shí)間=758.50，P<0.01)，視神經(jīng)中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BDNF：F分組=729.30，P<0.01；F時(shí)間=148.40，P<0.01.Gap-43：F分組=580.00，P<0.01；F時(shí)間=217.00，P<0.01)。造模后30 d和60 d,PRP組視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較模型對(duì)照組和生理鹽水組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。PRP組造模后60 d視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF和Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量較造模后30 d明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表4，5)。

表4 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 4 Comparison of BDNF mRNA expression at different time points among the four groups (mean±SD)組別 造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組0.747±0.024a0.813±0.013a0.973±0.038a0.885±0.017a模型對(duì)照組0.173±0.006a0.047±0.012ab0.210±0.053a0.113±0.021ab生理鹽水組0.213±0.015a0.050±0.010ab0.203±0.042a0.110±0.010abPRP組0.490±0.0520.147±0.006b0.610±0.0400.233±0.015b 注:視網(wǎng)膜:F分組=1164.00,P<0.01;F時(shí)間=240.90,P<0.01.視神經(jīng):F分組=729.30,P<0.01;F時(shí)間=148.40,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) BDNF:腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子;PRP:富血小板血漿 Note:Retina:Fgroup=1164.00,P<0.01;Ftime=240.90,P<0.01.Optical nerve:Fgroup=729.30,P<0.01;Ftime=148.40,P<0.01.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with correspond-ing values at 30 days after modeling in each group,bP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) BDNF:brain-derived neurotrophic factor;PRP:plate-let-rich plasma

表5 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 5 Comparison of Gap-43 mRNA expression at differenttime points among the four groups (mean±SD)組別 造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)中Gap-43 mRNA相對(duì)表達(dá)量30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組1.325±0.032a1.374±0.024a0.734±0.028a0.706±0.016a模型對(duì)照組0.323±0.059a0.087±0.012ab0.277±0.038a0.153±0.032ab生理鹽水組0.527±0.055a0.093±0.006ab0.297±0.015a0.157±0.006abPRP組1.030±0.0170.170±0.010b0.573±0.0150.287±0.025b 注:視網(wǎng)膜:F分組=1477.00,P<0.01;F時(shí)間=758.50,P<0.01.視神經(jīng):F分組=580.00,P<0.01;F時(shí)間=217.00,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Gap-43:生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43;PRP:富血小板血漿 Note:Retina:Fgroup=1477.00,P<0.01;Ftime=758.50,P<0.01.Optical nerve:Fgroup=580.00,P<0.01;Ftime=217.00,P<0.01.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with correspond-ing values at 30 days after modeling in each group,bP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) Gap-43:growth associated protein-43;PRP:platelet-rich plasma

2.6 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF和Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BDNF：F分組=85.91，P<0.01；F時(shí)間=29.50，P<0.01.Gap-43：F分組=136.20，P<0.01；F時(shí)間=23.73，P<0.01)，視神經(jīng)中BDNF和Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(BDNF：F分組=132.30，P<0.01；F時(shí)間=37.23，P<0.01.Gap-43：F分組=114.30，P<0.01；F時(shí)間=20.60，P<0.01)。造模后30 d和60 d，PRP組視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量均較模型對(duì)照組和生理鹽水組明顯升高，PRP組造模后60 d視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中BDNF和Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量均較造模后30 d明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5，表6，表7)。

圖5 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BNDF和Gap-43蛋白表達(dá)電泳圖 A：BNDF蛋白表達(dá)電泳圖 B：Gap-43蛋白表達(dá)電泳圖 1:正常對(duì)照組；2：模型對(duì)照組；3：生理鹽水組；4：PRP組；BDNF：腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；PRP：富血小板血漿；Gap-43：生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43Figure 5 Electrophoretogram of BNDF and GAP-43 protein expression in retina and optic nerve at different time points after modeling in the four groups A：Electrophoretogram of BNDF protein expression B：Electrophoretogram of GAP-43 protein expression 1：normal control group;2：model control group;3：normal saline group;4：PRP group;BDNF：brain-derived nerve growth factor;GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;PRP：platelet-rich plasma;GAP-43：growth associated protein-43

表6 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 6 Comparison of BDNF protein expression at differenttime points among the four groups (mean±SD)組別 造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)中BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組0.731±0.116a0.692±0.119a0.665±0.077a0.621±0.015a模型對(duì)照組0.242±0.068a0.095±0.026ab0.200±0.042a0.062±0.015ab生理鹽水組0.283±0.058a0.104±0.027ab0.199±0.048a0.089±0.024abPRP組0.560±0.0720.366±0.031b0.551±0.0730.319±0.076b 注:視網(wǎng)膜:F分組=85.91,P<0.01;F時(shí)間=29.50,P<0.01.視神經(jīng):F分組=132.30,P<0.01;F時(shí)間=37.23,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) BDNF:腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子;PRP:富血小板血漿 Note:Retina:Fgroup=85.91,P<0.01;Ftime=29.50,P<0.01.Optical nerve:Fgroup=132.30,P<0.01;Ftime=37.23,P<0.01.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with cor-responding values at 30 days after modeling in each group,bP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) BDNF:brain-derived neurotrophic factor;PRP:platelet-rich plasma

表7 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜和視神經(jīng)中Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 7 Comparison of Gap-43 protein expression at differenttime points among the four groups (mean±SD)組別 造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量造模后不同時(shí)間點(diǎn)視神經(jīng)中Gap-43蛋白相對(duì)表達(dá)量30d(n=3)60d(n=3)30d(n=3)60d(n=3)正常對(duì)照組0.680±0.071a0.697±0.093a0.651±0.093a0.602±0.076a模型對(duì)照組0.207±0.029a0.072±0.010ab0.180±0.038a0.074±0.011ab生理鹽水組0.237±0.045a0.083±0.012ab0.201±0.024a0.104±0.023abPRP組0.558±0.0720.389±0.051b0.474±0.0460.327±0.063b 注:視網(wǎng)膜:F分組=136.20,P<0.01;F時(shí)間=23.73,P<0.01.視神經(jīng):F分組=114.30,P<0.01;F時(shí)間=20.60,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)PRP組比較,aP<0.05;與各自組內(nèi)造模后30d比較,bP<0.05(兩因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) Gap-43:生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43;PRP:富血小板血漿 Note:Retina:Fgroup=136.20,P<0.01;Ftime=23.73,P<0.01.Optical nerve:Fgroup=114.30,P< 0.01;Ftime=20.60,P<0.01.Compared with the PRP group at corresponding time points,aP<0.05;compared with correspond-ing values at 30 days after modeling in each group,bP<0.05 (Two-way ANOVA,LSD-t test) Gap-43:growth associated protein-43;PRP:platelet-rich plasma

3 討論

視神經(jīng)損傷主要表現(xiàn)為RGCs的軸突損傷，由于軸突再生的缺乏，導(dǎo)致視覺出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損害。軸突無法再生可部分歸因于神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕和髓磷脂所形成的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制環(huán)境，以及軸突再生能力不足[12]。此外，RGCs在視神經(jīng)損傷后發(fā)生細(xì)胞凋亡[13]。死亡的RGCs可激活視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放大量炎性因子與毒性物質(zhì)，進(jìn)一步加重組織損傷[14-15]。目前尚無一種治療方法能夠有效刺激軸突再生并修復(fù)視覺通路中的軸突連接[16]。視神經(jīng)鉗夾傷模型具有安全性高、損傷程度穩(wěn)定可控、造模成功率高的特點(diǎn)[17]。本研究中采用視神經(jīng)鉗夾法建立視神經(jīng)損傷模型，通過視神經(jīng)外觀、視神經(jīng)及視網(wǎng)膜組織病理學(xué)染色證實(shí)視神經(jīng)軸突崩解和丟失，視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，球后注射PRP可有效修復(fù)視神經(jīng)損傷模型中視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)，減緩組織的繼發(fā)性損傷。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中重要的蛋白酶，而Bcl-2可以抑制由多種細(xì)胞毒因素所引起的細(xì)胞死亡。本研究中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，視神經(jīng)損傷模型視網(wǎng)膜中caspase-3陽(yáng)性染色強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯升高，而Bcl-2陽(yáng)性染色強(qiáng)度較正常對(duì)照組明顯降低，說明視神經(jīng)鉗夾法造成了視神經(jīng)的損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。而PRP組視網(wǎng)膜中caspase-3陽(yáng)性染色強(qiáng)度較模型對(duì)照組明顯降低，Bcl-2陽(yáng)性染色強(qiáng)度較模型對(duì)照組升高，證實(shí)球后注射PRP提高了細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)，并下調(diào)了caspase-3的產(chǎn)生，從而抑制了caspase-3相關(guān)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其緩解組織損傷的作用。同時(shí)PRP組的視神經(jīng)較模型對(duì)照組擁有較大的直徑以及更為完整的組織結(jié)構(gòu)，且視網(wǎng)膜較模型對(duì)照組擁有更多的RGCs數(shù)量以及更為完整的RNFL結(jié)構(gòu)和厚度，因此認(rèn)為PRP可有效減輕視神經(jīng)受損后視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的急性水腫和繼發(fā)性變性萎縮，而這一療效可能通過其抑制細(xì)胞凋亡，減少RGCs細(xì)胞的繼發(fā)性凋亡而發(fā)揮作用。

在以上諸多因素中，神經(jīng)軸鎖斷裂所導(dǎo)致的內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子供應(yīng)中斷是視神經(jīng)損傷以及RGCs凋亡的關(guān)鍵因素[13]。因此推測(cè)，可通過外源性補(bǔ)充神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來減緩或抑制視神經(jīng)損傷后的RGCs凋亡，甚至促進(jìn)已損傷的視神經(jīng)修復(fù)再生，從而為治療視神經(jīng)損傷和促進(jìn)視覺功能恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)起重要作用[18-20]，其被認(rèn)為是傳統(tǒng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中針對(duì)RGCs軸突受損有效的生存因子[21-22]。Gap-43是一種富集在生長(zhǎng)錐的膜相關(guān)磷脂蛋白，具有促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、再生及軸突導(dǎo)向的作用。Gap-43能夠促進(jìn)突觸形成，抑制其壞死和回縮，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)軸突再生[23-24]；目前其被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育和損傷修復(fù)過程中軸突生長(zhǎng)的標(biāo)志蛋白[25]。本研究通過PCR證實(shí)球后注射PRP促進(jìn)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF和Gap-43 mRNA表達(dá)，進(jìn)一步進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)證實(shí)BDNF和Gap-43蛋白含量上升，說明球后注射PRP可以緩解組織損傷，還通過上調(diào)相關(guān)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的含量而促進(jìn)組織修復(fù)。此外，PRP本身還可提供血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種生長(zhǎng)因子，從而為視神經(jīng)的修復(fù)起到積極作用[3]。

PRP的臨床應(yīng)用具有許多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：(1)無免疫排斥反應(yīng)；(2)制備簡(jiǎn)單、操作易行；(3)含有多種高濃度的生長(zhǎng)因子；(4)對(duì)機(jī)體無不良反應(yīng)[26]。因此PRP治療視神經(jīng)損傷是一個(gè)安全且有效的途徑，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展前景。

本研究結(jié)果表明，PRP可有效抑制視神經(jīng)損傷后RGCs的凋亡及視網(wǎng)膜的繼發(fā)性損傷，從而減緩視神經(jīng)損傷后的視網(wǎng)膜和視神經(jīng)損傷，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)效果更明顯；同時(shí)通過上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)有效促進(jìn)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的修復(fù)，但是隨著時(shí)間增加效果減弱。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突